李琰，趙磊，崔蕾，雷嘉敏，張興

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誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

李琰1,2，趙磊1,2，崔蕾1,2，雷嘉敏1,2，張興2

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100 2 西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100

李琰, 趙磊, 崔蕾, 等. 誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(5): 734–743.Li Y, Zhao L, Cui L, et al. Effects of elicitors on growth of adventitious roots and contents of secondary metabolites in Tripterygium wilfordii Hook. f.. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 734–743.

為探討真菌誘導(dǎo)子以及硝酸銀等非生物誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長及次生代謝產(chǎn)物含量的影響。以雷公藤不定根為材料，通過向培養(yǎng)基中添加不同種類的真菌誘導(dǎo)子以及硝酸銀等非生物誘導(dǎo)子，采用高效液相色譜檢測不定根中雷公藤甲素和生物堿含量。結(jié)果表明：各種真菌誘導(dǎo)子不影響不定根的生長，但對(duì)次生代謝產(chǎn)物含量有顯著影響，其中，蘋果炭疽和柿子炭疽誘導(dǎo)子的加入不僅使不定根中雷公藤甲素的含量分別提高了2.24和1.93倍，生物堿的含量也各提高了2.02和2.07倍。蘋果炭疽誘導(dǎo)子濃度為50 μg/mL時(shí)比較適合雷公藤不定根生長及雷公藤甲素和生物堿的積累。硝酸銀抑制不定根的生長和生物堿的積累，但促進(jìn)雷公藤甲素的積累。硝酸銀濃度為25 μmol/L時(shí)雷公藤甲素含量為對(duì)照的1.71倍。茉莉酸甲酯濃度為50 μmol/L時(shí)，不定根增長量為對(duì)照的1.04倍，雷公藤甲素和生物堿含量分別為對(duì)照的1.64倍和2.12倍。酵母提取物濃度為2 g/L時(shí)，雷公藤甲素含量為對(duì)照的1.48倍。表明培養(yǎng)基中添加硝酸銀和酵母提取物對(duì)不定根中雷公藤甲素的合成具有明顯的促進(jìn)作用，蘋果炭疽和茉莉酸甲酯的協(xié)同作用既能促進(jìn)雷公藤甲素的合成又能促進(jìn)雷公藤生物堿的合成。

雷公藤，不定根，誘導(dǎo)子，次生代謝產(chǎn)物

通過植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時(shí)，往往添加誘導(dǎo)子來改變細(xì)胞的代謝途徑和代謝強(qiáng)度，從而提高植物組織培養(yǎng)物中有用次生代謝產(chǎn)物的積累，為植物細(xì)胞次生代謝的調(diào)控提供了新的手段，這一方法越來越引起人們的關(guān)注[1-2]。近幾年誘導(dǎo)子被廣泛地用于促進(jìn)各種細(xì)胞培養(yǎng)物中次生代謝產(chǎn)物的生物合成[3-5]，研究表明誘導(dǎo)子的作用效果與誘導(dǎo)子的種類、濃度以及作用時(shí)間等因素有關(guān)[6-7]，有時(shí)不同誘導(dǎo)子之間還存在一定的協(xié)同效應(yīng)，兩種或兩種以上誘導(dǎo)子的協(xié)同作用可產(chǎn)生更強(qiáng)的誘導(dǎo)效果[8-9]。

雷公藤Hook. f. 作為傳統(tǒng)的殺蟲植物及藥用植物，其主要活性成分雷公藤甲素和雷公藤生物堿等次生代謝產(chǎn)物主要存在于根皮中[10-11]。其根皮在我國民間常用于防治多種蔬菜害蟲，根皮提取物對(duì)小菜蛾、菜青蟲等害蟲有強(qiáng)烈的胃毒、拒食或麻痹作用[12-14]。雷公藤甲素和雷公藤生物堿也是臨床上用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗腫瘤和免疫抑制性疾病的主要成 分[15-17]，雷公藤屬于木本植物，生長緩慢，有效成分含量較低[11,18]，使市場開發(fā)新藥以及生物農(nóng)藥的使用受到了限制。為了解決這一問題，我們進(jìn)行了利用植物組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)雷公藤次生代謝產(chǎn)物的研究[19-20]，為了進(jìn)一步提高其次生代謝產(chǎn)物的含量，從誘導(dǎo)子種類、添加濃度及時(shí)間、誘導(dǎo)子協(xié)同作用等對(duì)雷公藤不定根增長量和次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雷公藤不定根：為本實(shí)驗(yàn)室多代馴化培養(yǎng)的穩(wěn)定的不定根培養(yǎng)體系作為供試材料。

所用病原菌：小麥根腐、蘋果炭疽、柿子炭疽、美味牛肝菌、尖孢鐮刀菌、小麥全蝕，均由本實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心提供。

儀器與試劑：日本島津LC-6ATVP高效液相色譜儀，紫外檢測器。UV120-02型紫外/可見分光光度計(jì) (日本島津)。雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品 (批號(hào)1566-200201，純度95%) 由中國藥品生物制品鑒定所提供。雷公藤生物堿，由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供，為本課題組從雷公藤根皮中提取得到，經(jīng)光譜鑒定結(jié)構(gòu)HPLC面積歸一法測定純度大于95%。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 雷公藤不定根的培養(yǎng)

雷公藤不定根繼代培養(yǎng)均以NT為基本培養(yǎng)基，添加4.0 mg/L奈乙酸 (NAA)、1.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D) 和0.5 mg/L激動(dòng)素 (KT)，加入蔗糖30 g/L，250 mL三角瓶內(nèi)裝 100 mL培養(yǎng)基，接種量為10 g/L新鮮不定根，pH用PHS-2C型酸度計(jì)高壓滅菌前調(diào)至5.8。在溫度 (25±1) ℃，在自然光照下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。培養(yǎng)結(jié)束后將不定根用去離子水沖洗過濾后冷凍干燥至恒重，按照不定根增長量=收獲量/瓶?接種量/瓶，計(jì)算不定根增長量，并將其粉碎過60目篩，冷藏保存用以提取雷公藤甲素和雷公藤生物堿。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 誘導(dǎo)子的制備和添加

將以上病原菌接種在PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，將活化后的菌種接種在PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min搖床上培養(yǎng)1周收獲菌絲，參照文獻(xiàn)[21]的方法制備真菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)子，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，用蒽酮比色法測定誘導(dǎo)子提取物中多糖含量。誘導(dǎo)子的加入量按溶液中含糖量計(jì)算，單位為mg GE/L葡萄糖當(dāng)量 (Glucose equivalent)。

1.2.3 不同種類真菌誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

向繼代培養(yǎng)30 d的不定根中添加50 μg/mL小麥根腐、蘋果炭疽、柿子炭疽、美味牛肝菌、尖孢鐮刀菌及小麥全蝕6種誘導(dǎo)子，培養(yǎng)至第45天收獲不定根。

1.2.4 不同濃度蘋果炭疽病原菌對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

向繼代培養(yǎng)30 d的不定根中添加10、30、50、70、100、200 μg/mL蘋果炭疽誘導(dǎo)子，培養(yǎng)至第45天收獲不定根。

1.2.5 誘導(dǎo)子添加時(shí)間對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

向繼代培養(yǎng)第15、20、25、30、35、40 d的不定根中添加50 μg/mL蘋果炭疽誘導(dǎo)子，培養(yǎng)至第45天收獲不定根。

1.2.6 誘導(dǎo)子作用時(shí)間對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

向繼代培養(yǎng)第30天的不定根中添加 50 μg/mL蘋果炭疽誘導(dǎo)子，培養(yǎng)至誘導(dǎo)子加入后0、5、10、15、20、25 d收獲不定根。

1.2.7 非生物誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

向繼代培養(yǎng)第30天的不定根中添加0、5、10、25、50、100μmol/L硝酸銀 (過濾滅菌法，下同)，0、10、30、50、75、100μmol/L茉莉酸甲酯，0、0.5、1、2、5、10g/L酵母提取物，培養(yǎng)至第45天收獲不定根。

1.2.8 誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

向繼代培養(yǎng)第30天的不定根中同時(shí)添加50 μg/mL蘋果炭疽病原菌誘導(dǎo)子和25 μmol/L硝酸銀以及50 μg/mL蘋果炭疽病原菌誘導(dǎo)子和50 μmol/L茉莉酸甲酯，培養(yǎng)至誘導(dǎo)子加入后0、5、10、15、20、25 d收獲不定根。

1.3 次生代謝產(chǎn)物含量的測定

參照文獻(xiàn)[22]的方法對(duì)雷公藤次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行測定。稱取雷公藤不定根樣品1 g，置于磨口瓶中，加入乙酸乙酯20 mL過夜，超聲提取40 min，過中性氧化鋁柱，減壓回收乙酸乙酯，用45%甲醇溶解并定容至5 mL，測定雷公藤甲素和生物堿含量。

雷公藤甲素含量的測定采用HPLC法，色譜條件為，色譜柱C18(4.6 mm×250 mm) 5 μm；流動(dòng)相，甲醇∶水 = 45∶55；流速1 mL/min；檢測波長為218 nm；以雷公藤甲素為標(biāo)準(zhǔn)品，用45%甲醇溶解并定容制得100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)液用45%甲醇稀釋成1、10、30、50、75、100 μg/mL系列濃度溶液，分別進(jìn)樣3次，以峰面積平均值 () 為縱坐標(biāo)，濃度 () 為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程為：= 46 866– 10 771，2= 0.999 9。

雷公藤生物堿含量的測定采用紫外分光光度法，將提取液用45%甲醇稀釋10–30倍，用紫外/可見分光光度計(jì)在268 nm波長下進(jìn)行比色，測定吸光度；以生物堿為標(biāo)準(zhǔn)品，用45%甲醇溶解并定容制得100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液用45%甲醇稀釋成5、10、40、60、80、100 μg/mL系列濃度溶液，以45%甲醇為空白對(duì)照，于 268 nm波長處測定吸光度 (值)。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：=0.008 7?0.008 1，2=0.999 8。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.1.1 不同種類真菌誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

在培養(yǎng)30 d的雷公藤不定根中加入真菌誘導(dǎo)子后不定根增長量和對(duì)照相比差異并不明顯 (圖1)，而對(duì)不定根中雷公藤甲素和生物堿的含量差異較大。各種誘導(dǎo)子的加入對(duì)不定根中雷公藤甲素和生物堿的含量均有不同程度的提高。其中，蘋果炭疽 (GC) 和柿子炭疽 (CG) 誘導(dǎo)子的加入使不定根的增長量分別為對(duì)照的96.40%和95.68%，而不定根中雷公藤甲素的含量和對(duì)照相比分別提高了2.24和1.93倍，生物堿的含量和對(duì)照相比也各提高了2.02和2.07倍。其他誘導(dǎo)子的添加不定根中雷公藤甲素和生物堿的含量也有不同程度的提高。

2.1.2 不同濃度蘋果炭疽誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

蘋果炭疽誘導(dǎo)子濃度在0–50 μg/mL時(shí)對(duì)不定根增長量差異并不明顯 (圖2) 當(dāng)濃度超過50 μg/mL時(shí)，不定根卷曲，生長速度下降明顯，濃度在100 μg/mL時(shí)，不定根增長量為對(duì)照的87.77%，但不定根中雷公藤甲素含量達(dá)到最大值，為對(duì)照的2.66倍，當(dāng)濃度為200 μg/mL時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，不定根顏色變深，逐漸失去光澤，并在第35天就停止生長，雷公藤甲素含量也明顯下降。生物堿含量在試驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著誘導(dǎo)子濃度的增加而升高，當(dāng)誘導(dǎo)子濃度為200 μg/mL時(shí)，生物堿含量為對(duì)照的2.52倍。

圖1 不同種類真菌誘導(dǎo)子對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

圖2 不同濃度蘋果炭疽誘導(dǎo)子對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.1.3 誘導(dǎo)子添加時(shí)間對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤不定根的生長周期約為40 d，接種后第15 天進(jìn)入快速生長期，第25 天時(shí)生長速度最快，第30 天進(jìn)入穩(wěn)定生長期。為了確定誘導(dǎo)子的最佳添加時(shí)間，分別在不定根接種后不同時(shí)間加入蘋果炭疽誘導(dǎo)子，第45天收獲不定根 (圖3) 發(fā)現(xiàn)，不定根增長量隨著生長時(shí)間的延長而增加，雷公藤甲素含量在第15天至第30天加入差異并不明顯，第35天以后加入含量明顯開始下降，而生物堿含量是誘導(dǎo)子加入的越早含量越高。

圖3 誘導(dǎo)子添加時(shí)間對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.1.4 誘導(dǎo)子作用時(shí)間對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

在培養(yǎng)30 d的不定根中，加入50 μg/mL蘋果炭疽誘導(dǎo)子后每隔5 d收獲1次不定根，隨著誘導(dǎo)子作用時(shí)間的延長不定根增長量呈下降趨勢 (圖4)，雷公藤甲素含量在加入第15天時(shí)最高，以后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸下降，生物堿含量隨著作用時(shí)間的延長而增加，但生物堿含量在添加第10天至第25天差異并不明顯。

圖4 誘導(dǎo)子作用時(shí)間對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.2 非生物誘導(dǎo)子對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.2.1 硝酸銀對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

培養(yǎng)基中加入硝酸銀對(duì)雷公藤不定根的生長、雷公藤甲素及生物堿含量均有較大的影響 (圖5)。不定根增長量隨著硝酸銀濃度的升高而下降，雷公藤甲素含量隨著硝酸銀濃度的增加均有不同程度的提高，在硝酸銀濃度為 25 μmol/L時(shí)，不定根增長量為對(duì)照的86.03%，雷公藤甲素含量為對(duì)照的1.71倍。硝酸銀的加入不利于不定根中生物堿的合成，生物堿含量隨著硝酸銀濃度的升高而降低，當(dāng)硝酸銀濃度為100 μmol/L時(shí)，生物堿含量僅為對(duì)照的68.77%。

圖5 硝酸銀對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.2.2 茉莉酸甲酯對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

適宜濃度茉莉酸甲酯的加入對(duì)雷公藤不定根的生長、雷公藤甲素及生物堿含量均有不同程度的提高 (圖6)。適合不定根生長的茉莉酸甲酯濃度為30 μmol/L，當(dāng)茉莉酸甲酯濃度為 50 μmol/L時(shí)，雷公藤甲素含量為對(duì)照的1.64倍，生物堿含量為對(duì)照的2.12倍，此時(shí)不定根增長量為對(duì)照的1.04倍。

圖6 茉莉酸甲酯對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度的酵母提取物不僅能促進(jìn)不定根的生長，也明顯促進(jìn)雷公藤甲素的形成 (圖7)。當(dāng)酵母提取物濃度為1 g/L時(shí)，不定根增長量為對(duì)照的1.12倍，酵母提取物濃度為2 g/L時(shí)，雷公藤甲素含量為對(duì)照的1.48倍，但酵母提取物明顯抑制雷公藤生物堿的合成，且濃度越大抑制作用越強(qiáng)。

圖7 酵母提取物對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.3 誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

2.3.1 蘋果炭疽誘導(dǎo)子和硝酸銀協(xié)同作用對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

蘋果炭疽誘導(dǎo)子和硝酸銀的協(xié)同作用對(duì)不定根生長、雷公藤甲素及生物堿的含量影響差異較大 (圖8)，隨著誘導(dǎo)子作用時(shí)間的延長不定根增長量比各自單獨(dú)加入明顯下降，但雷公藤甲素含量比各自單獨(dú)加入明顯升高，雷公藤甲素含量達(dá)到最大值的時(shí)間也比單獨(dú)加入提前了5 d，在加入的第10天達(dá)到最大值，為單獨(dú)使用蘋果炭疽誘導(dǎo)子1.16倍，為單獨(dú)使用硝酸銀的1.51倍。生物堿含量在加入第20 天時(shí)最高。比單獨(dú)加入蘋果炭疽誘導(dǎo)子的含量下降了16.50%，但為單獨(dú)加入硝酸銀的2.25倍。

2.3.2 蘋果炭疽誘導(dǎo)子和茉莉酸甲酯協(xié)同作用對(duì)雷公藤不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

在培養(yǎng)基中同時(shí)加入蘋果炭疽誘導(dǎo)子和茉莉酸甲酯后不定根增長量明顯提高 (圖9)，在加入的第10天，不定根增長量均高于二者單獨(dú)添加。在加入的第10天雷公藤甲素含量達(dá)到最大值，為單獨(dú)使用茉莉酸甲酯的1.19倍，但比單獨(dú)使用蘋果炭疽誘導(dǎo)子下降了13.92%。生物堿含量在添加的第15天達(dá)到最大值，和單獨(dú)使用茉莉酸甲酯接近，為單獨(dú)使用蘋果炭疽誘導(dǎo)子的1.11倍。

圖8 蘋果炭疽誘導(dǎo)子和硝酸銀協(xié)同作用對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

圖9 蘋果炭疽誘導(dǎo)子和茉莉酸甲酯協(xié)同作用對(duì)不定根生長和次生代謝產(chǎn)物含量的影響

3 討論

利用誘導(dǎo)子激活植物細(xì)胞中的次生代謝途徑已成為提高藥用植物組織培養(yǎng)中藥用成分積累的有效方法[23]。前人研究證明，不同種類的真菌誘導(dǎo)子在不同植物細(xì)胞次生代謝調(diào)節(jié)中，因其所具有的能被細(xì)胞受體所接受的信息類型、添加時(shí)間不同，使誘導(dǎo)反應(yīng)的類型和強(qiáng)度不同，從而使不同誘導(dǎo)子表現(xiàn)出的誘導(dǎo)活性有明顯的差異。同樣用大麗花輪枝孢、葡枝根霉和束狀刺盤孢處理青蒿的發(fā)狀根，雖然均能促進(jìn)發(fā)根中青蒿素的積累，但以大麗花輪枝孢的誘導(dǎo)效果最好，經(jīng)大麗花輪枝孢處理的發(fā)根中青蒿素含量比對(duì)照提高了45%[24]。Namdeo等在長春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中，加入黑曲霉等抽提物，阿瑪堿的含量比對(duì)照提高了3倍[25]。本研究結(jié)果表明，蘋果炭疽誘導(dǎo)子的加入對(duì)雷公藤不定根中雷公藤甲素和生物堿含量影響最大，對(duì)雷公藤甲素和生物堿含量分別提高2.24倍和2.02倍。有關(guān)蘋果炭疽誘導(dǎo)子的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，真菌誘導(dǎo)子種類、濃度和添加時(shí)間對(duì)不定根的生長、雷公藤甲素及生物堿含量影響較大。一般高濃度誘導(dǎo)子對(duì)細(xì)胞生長損傷較大，甚至使細(xì)胞停滯生長，可能是來源于真菌的誘導(dǎo)子大多有很強(qiáng)的毒性。雖然降低誘導(dǎo)子濃度可以減少對(duì)細(xì)胞的傷害，但低濃度的誘導(dǎo)子只能引起部分誘導(dǎo)，所需的目的產(chǎn)物積累也就達(dá)不到最佳狀態(tài)。本試驗(yàn)中，隨著蘋果炭疽誘導(dǎo)子濃度的提高，不定根增長量呈下降趨勢，且濃度越大下降趨勢越明顯。當(dāng)濃度超過100 μg/mL時(shí)，雷公藤甲素含量也開始下降。一般認(rèn)為培養(yǎng)物只有處于一定生長時(shí)期時(shí)才能有效地接受誘導(dǎo)子信號(hào)，使誘導(dǎo)子表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性，本試驗(yàn)中，不定根在生長至對(duì)數(shù)期末期加入誘導(dǎo)子效果最好，而延遲期以后加入雷公藤甲素和生物堿含量均開始下降。這和張堅(jiān)等[26]在對(duì)杠柳不定根培養(yǎng)生產(chǎn)杠柳毒苷研究時(shí)得出的結(jié)論相一致。

Ag+作為乙烯合成酶的抑制劑，往往通過調(diào)節(jié)乙烯合成來改變植物細(xì)胞的代謝[27]。Pitta-Alvarez等[28]報(bào)道，硝酸銀能使發(fā)狀根中的東莨菪堿和生物堿含量分別提高3倍和5–8倍。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硝酸銀能明顯促進(jìn)雷公藤不定根中雷公藤甲素的合成。張堅(jiān)等[26]在對(duì)杠柳不定根培養(yǎng)研究以及Zhang 等[27]在對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)的研究中也得出了類似的結(jié)論。以前曾有人報(bào)道，誘導(dǎo)子協(xié)同作用能顯著提高次生代謝的產(chǎn)率[28-29]。苗志奇等[30]在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中通過AgNO3和水楊酸的協(xié)同作用，使紫杉醇的含量比兩個(gè)誘導(dǎo)子單獨(dú)作用時(shí)的最高含量之和還高出50%。本試驗(yàn)中蘋果炭疽誘導(dǎo)子和AgNO3的協(xié)同作用中，雷公藤甲素的含量均高于兩者單獨(dú)使用，但生物堿含量比單獨(dú)使用蘋果炭疽誘導(dǎo)子下降了10.18%。而雷公藤不定根與誘導(dǎo)子和誘導(dǎo)產(chǎn)物之間的相關(guān)性，如何促使信號(hào)傳導(dǎo)途徑的開放，代謝途徑中相關(guān)酶活性是怎么提高，如何促進(jìn)mRNA的轉(zhuǎn)錄等，都需要作進(jìn)一步研究。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Effects of elicitors on growth of adventitious roots and contents of secondary metabolites inHook. f.

Yan Li1,2, Lei Zhao1,2, Lei Cui1,2, Jiamin Lei1,2, and Xing Zhang2

1,712100,2,,,712100,,

To study the effects of the extract of fungal elicitor, AgNO3, MeJA and yeast on the growth and content of secondary metabolites of adventitious roots in. The above elicitors were supplemented to the medium, the growth and the content of secondary metabolites were measured. When the medium was supplemented with the elicitoror,the content of triptolide was increased by 2.24 and 1.93-fold, the alkaloids content was increased by 2.02 and 2.07-fold, respectively. The optimal concentration ofwas 50 μg/mL for accumulation of triptolide, alkaloids and for the growth of adventitious roots. AgNO3inhibited the growth of adventitious roots and the accumulation of the alkaloids, whereas it (at 25 μmol/L) increased the accumulation of triptolide by 1.71-fold compared to the control. The growth of adventitious roots, the contents of triptolide and alkaloids were increased 1.04, 1.64 and 2.12-folds, respectively when MeJA was at 50 μmol/L. When the concentration of yeast reached 2 g/L, the content of triptolide increased 1.48-folds. This research demonstrated that supplementation of AgNO3and yeast enhanced the biosynthesis of triptolide in adventitious roots and the synergism ofand MeJA could promote the biosynthesis of both triptolide and alkaloids.

Hook. f., adventitious root, elicitor, secondary metabolites

September 15, 2014; Accepted: November 15, 2014

Yan Li. Tel: +86-29-87092122; E-mail: ly2659@163.com

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA10A202), Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No. 2011JM3006).

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No. 2011AA10A202)，陜西省自然科學(xué)基金 (No. 2011JM3006) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-04-03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150403.1000.001.html