孫啟星，陳旭升，任喜東，鄭根成，毛忠貴

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基于pH調(diào)節(jié)和有機氮源流加調(diào)控補料分批發(fā)酵過程提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量

孫啟星，陳旭升，任喜東，鄭根成，毛忠貴

江南大學生物工程學院工業(yè)生物教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122

孫啟星,陳旭升,任喜東, 等. 基于pH調(diào)節(jié)和有機氮源流加調(diào)控補料分批發(fā)酵過程提高ε-聚賴氨酸產(chǎn)量. 生物工程學報, 2015, 31(5): 752?756.Sun QX, Chen XS, Ren XD, et al. Enhanced ε-poly-L-lysine production through pH regulation and organic nitrogen addition in fed-batch fermentation. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 752?756.

為了解決ε-聚賴氨酸 (ε-PL) 補料分批發(fā)酵過程中后期ε-PL產(chǎn)率下降的問題，提出了在補料階段利用調(diào)節(jié)pH值和流加有機氮源 (酵母粉) 兩種手段來提高ε-PL產(chǎn)率。利用上述兩種策略，實現(xiàn)ε-PL平均產(chǎn)率分別達到4.62 g/(L·d) 和5.16 g/(L·d)，較未調(diào)控補料分批發(fā)酵(典型補料分批發(fā)酵) 分別提高了27.3%和42.15%；同時，實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量分別達到36.95 g/L和41.32 g/L，較未調(diào)控補料分批發(fā)酵分別提高了27.4%和42.48%。進一步細胞活性染色和關鍵酶活性分析發(fā)現(xiàn)，兩種策略均能顯著提高細胞活力和關鍵酶活性。該研究結果表明，在發(fā)酵中后期通過調(diào)節(jié)pH值和流加酵母粉兩種措施能夠顯著增強細胞活性和產(chǎn)生菌代謝能力，從而達到提高ε-PL產(chǎn)率和產(chǎn)量的目的。

ε-聚賴氨酸，細胞活力，鏈霉菌M-Z18，補料分批發(fā)酵

ε-聚賴氨酸 (ε-poly-L-lysine，ε-PL) 是由25–35個L-賴氨酸單體通過聚合酶催化α-COOH和ε-NH2縮合而成的一種同型氨基酸聚合物。ε-PL作為一種安全而高效的生物防腐劑被廣泛應用于日本、韓國和歐美等國家和地區(qū)的食品工業(yè)[1-2]；我國也于2014年4月批準其作為食品防腐劑在淀粉制品、肉制品和果蔬制品等食品中的使用[3]。另外，它還可以用作生物可降解材料、乳化劑、高吸收性水凝膠、藥物載體、抗癌增進劑和生物芯片外被等。因此，ε-PL有著廣泛的應用前景和巨大市場價值[4]。

當前，補料分批發(fā)酵是生產(chǎn)ε-PL的主要方式。Kahar等利用S410 (小白鏈霉菌S410) 借助pH控制和葡萄糖流加策略，實現(xiàn)192 h ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量達到48.3 g/L，這是目前報道的最高發(fā)酵水平[5]。采用上述同樣發(fā)酵控制策略，Shih和Shen利用IFO 14147經(jīng)過10 d連續(xù)發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)量僅達到5.2 g/L[6]；Jia等利用TUST2經(jīng)過120 h補料分批發(fā)酵，實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量達到20.2 g/L[7]。Liu等[8]在上述工藝控制基礎上，借助原位分離與發(fā)酵耦合技術，利用sp. GIM8實現(xiàn)192 h ε-PL產(chǎn)量達到23.4 g/L。為了提高鏈霉菌生產(chǎn)ε-PL能力，本實驗室前期建立了一種基于甘油作為碳源的新型兩階段pH控制工藝，實現(xiàn)173 h ε-PL產(chǎn)量達到30.11 g/L[9-10]。然而，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當補料分批發(fā)酵進行到中后期，ε-PL產(chǎn)率會逐漸下降。為了進一步提高ε-PL產(chǎn)量，本文擬利用pH調(diào)節(jié)和流加有機氮源 (酵母粉) 的方法來提高ε-PL產(chǎn)率，達到提高ε-PL產(chǎn)量的目的；并初步分析兩種策略提高ε-PL產(chǎn)量的潛在原因。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

sp. M-Z18為本實驗室從土壤中篩選，經(jīng)多輪化學誘變篩選獲得的一株ε-PL高產(chǎn)突變株。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻[10]。

1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)方法參照文獻[9]。

5 L發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵：1) 典型ε-PL補料分批發(fā)酵過程參照文獻[10]進行；2) 調(diào)節(jié)pH調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵：在96 h將pH調(diào)至4.1維持21 h，然后使pH自然下降至發(fā)酵pH 3.8并維持至發(fā)酵結束，其他操作與典型ε-PL補料分批發(fā)酵保持一致；3) 流加酵母粉調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵：從80 h開始以3.13 mL/h的速度流加酵母粉溶液 (150 g/L) 至發(fā)酵罐中，到144 h結束，其他操作與典型ε-PL補料分批發(fā)酵保持一致。

1.3 測定方法

菌體干重 (DCW)、甘油和ε-PL含量測定均按文獻[11]進行。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)、天冬氨酸激酶 (ASPK)、檸檬酸合成酶 (CS)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶 (G6PDH) 酶活測定方法均按照文獻[12]進行。

細胞活力測定使用Bacstain-CTC rapid staining kit，測定方法參照文獻[13]進行。

2 結果與分析

2.1 不同策略調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵過程參數(shù)分析

2.1.1 典型ε-PL補料分批發(fā)酵過程

利用sp. M-Z18發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的典型補料分批發(fā)酵過程如圖1A所示。從圖中可以看出，菌體在20–110 h處于快速生長階段，并伴隨著ε-PL的快速積累；而當菌體生長進入平穩(wěn)期(110 h以后)，ε-PL積累速率逐漸下降直至停止。圖1D顯示的是菌體在每24 h內(nèi)積累ε-PL的產(chǎn)量，ε-PL產(chǎn)率在72–96 h達到最大7.05 g/(L·d)；隨后開始逐漸下降，到168–192 h ε-PL產(chǎn)率僅為1.52 g/(L·d)，遠低于ε-PL平均產(chǎn)率3.63 g/(L·d)，最終ε-PL產(chǎn)量僅為29 g/L (圖1A)。由此可以看出，ε-PL合成與菌體生長之間高度相關，這也驗證了其他學者關于ε-PL合成和菌體生長相偶聯(lián)的實驗結論[14-15]。圖1A顯示，在菌體生長進入平穩(wěn)期以前約10 h，溶氧出現(xiàn)緩慢上升趨勢并一直持續(xù)到發(fā)酵結束 (轉(zhuǎn)速和通氣量不變)，這表明菌體利用發(fā)酵液中溶解氧的能力在緩慢下降，也說明菌體的活力在逐漸下降。那么，有何措施提高菌體活力，以保持菌體處于持續(xù)生長狀態(tài)呢？

圖1 不同調(diào)控策略補料分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的過程參數(shù)

2.1.2 調(diào)節(jié)pH調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵過程

pH是調(diào)控ε-PL生產(chǎn)菌生長和ε-PL合成的關鍵因素：高pH (大于5.0) 有利于菌體生長，但ε-PL合成受到限制，甚至引起已積累的ε-PL分解；低pH (小于4.0) 有利于ε-PL的生物合成，但會限制菌體細胞的生長[5]。因此，當發(fā)酵過程中溶氧上升到一定程度 (30%)，通過適當提高pH值 (pH 4.1)并維持一段時間來促進菌體的繼續(xù)生長；而當溶氧處于穩(wěn)定下降趨勢后，再將pH值下調(diào)至最佳發(fā)酵pH (pH 3.8) 以繼續(xù)ε-PL的合成，實驗結果如圖1B所示。從圖中可以看出，在發(fā)酵100 h將pH提高至4.1以后，溶氧不會立即停止上升趨勢，這可能是因為菌體需要適應高pH環(huán)境的改變；直到110 h溶氧才開始穩(wěn)定下降；在120 h時將pH自然下調(diào)至pH 3.8，此時溶氧繼續(xù)快速下降并一直持續(xù)到150 h，這表明菌體恢復了之前的生長活力。從菌體生長也能看出，在將pH升高至4.1以及恢復3.8后菌體保持了較快的增長，一直持續(xù)到第2次溶氧上升。從ε-PL產(chǎn)量上來看，在溶氧上升之前 (85 h)，ε-PL被快速積累；但當溶氧上升后，ε-PL產(chǎn)率明顯下降。當pH升高至4.1以后，ε-PL合成停止；而當pH重新恢復3.8以后，ε-PL合成又伴隨著菌體的快速生長而被加快。從圖1D可以看出，發(fā)酵前96 h，ε-PL產(chǎn)率幾乎和典型補料分批發(fā)酵過程保持一致。由于96–120 h進行了升高pH調(diào)控操作，ε-PL產(chǎn)率顯著低于典型補料分批發(fā)酵方式。然而，從120 h以后，經(jīng)pH調(diào)節(jié)的ε-PL產(chǎn)率遠遠高于典型補料分批發(fā)酵。最終，經(jīng)過pH調(diào)控的補料分批發(fā)酵實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量達到36.95 g/L，較未調(diào)控發(fā)酵提高了27.4%。

2.1.3 流加酵母粉調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵過程

有機氮源是菌體生長的速效氮源，能顯著促進菌體的生長[16]。因此，在發(fā)酵過程溶氧上升之前就開始流加酵母粉，以保持菌體的持續(xù)生長，實驗結果如圖1C所示。從圖1C可以看出，80 h流加酵母粉之后，溶氧繼續(xù)保持快速下降趨勢，在120 h溶氧甚至維持在10%以下，在150 h之后才開始緩慢上升。菌體生長也在150 h之前保持著較快增長；與此同時，ε-PL產(chǎn)量在180 h之前均保持較快增加。由圖1D可以看出，從96 h開始ε-PL產(chǎn)率明顯高于典型補料分批發(fā)酵。最終，ε-PL產(chǎn)量達到41.32 g/L，平均產(chǎn)率達到5.16 g/(L·d)，比典型補料分批發(fā)酵結果分別提高了42.48% 和42.15%。

2.2 不同策略調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵過程的菌體活力變化

借助CTC細胞活性染色方法，如圖2A所示，發(fā)現(xiàn)典型補料分批發(fā)酵進行到120 h菌體的活性即明顯下降，到144 h以后菌體細胞幾乎完全喪失活性。然而，采用pH調(diào)控或流加酵母粉調(diào)控可以使得細胞活性延長到144 h (pH調(diào)控) 甚至168 h (流加酵母粉) 以后才開始下降。為了更具體地表征菌體細胞活力，將細胞熒光強度以灰度值 (Gray value) 來表示：灰度值越大，其熒光強度越強，表明細胞代謝活性越強；反之亦然。從圖2B可以看出，典型補料分批發(fā)酵灰度值從72 h開始快速下降，說明隨著發(fā)酵進行細胞活力在不斷下降，并且在168 h灰度值降低到最低。pH調(diào)節(jié)和流加酵母粉策略使其灰度值在72 h到120 h之間穩(wěn)定保持在較高水平，表明在此發(fā)酵期間細胞保持著較強的生理代謝活性；而從144 h開始，兩種策略下菌體灰度值開始逐漸降低，但是灰度值仍遠遠高于典型補料分批發(fā)酵。值得注意的是，pH調(diào)節(jié)策略在96 h即實現(xiàn)細胞活力最大程度提升；而流加酵母粉策略在120 h才實現(xiàn)最高細胞活力恢復。由此可以看出，pH調(diào)節(jié)較有機氮源流加在恢復菌體活力方面響應更快。造成有機氮源流加響應慢的原因可能在于流加初期有機氮源中含有的關鍵生長因子濃度還未達到細胞需求量，只有累積到一定濃度才能使得細胞恢復快速代謝能力。然而，pH調(diào)節(jié)策略168 h時灰度值為40左右，流加有機氮源策略168 h時灰度值還維持在70以上。綜上所述，pH調(diào)節(jié)策略能夠快速恢復菌體活力，但維持細胞活力時間較流加有機氮源明顯偏短。

2.3 不同策略調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵過程關鍵酶活性變化

為進一步闡述pH調(diào)節(jié)和酵母粉流加對補料分批發(fā)酵過程ε-PL合成的影響，考察了3種條件下ε-PL合成初級代謝途徑關鍵酶活性 (PEPC、CS、G6PDH和ASPK) 變化，實驗結果如圖3所示。典型補料分批發(fā)酵過程中4個關鍵酶活性均從72 h開始逐漸減小，說明細胞代謝活性和ε-PL產(chǎn)率降低并不是由于某個限制性酶引起的，而是由細胞整體活力降低導致。事實上，這一實驗結果與圖1D和圖2的結論相一致，只不過關鍵酶活性比ε-PL產(chǎn)率和細胞染色活性提前下降了約24 h。在pH調(diào)節(jié)和流加酵母粉策略調(diào)控下，PEPC、CS和ASPK酶活都高于典型補料分批發(fā)酵，這樣就為ε-PL的合成提供了大量的前體L-賴氨酸。同時，G6PDH酶活的增加會為細胞合成提供更多的碳骨架以用于細胞的生長。兩種策略雖然都顯著提高了關鍵酶活性，但作用機制可能不同。pH調(diào)節(jié)改變了菌體生長的低pH不利環(huán)境 (高pH有利于菌體生長)；而流加酵母粉為細胞提供了關鍵生長因子，如維生素、氨基酸、核苷酸等，促進了細胞的二次生長。由于ε-PL合成與菌體生長之間高度相關，因此不管是調(diào)節(jié)pH還是流加酵母粉均顯著促進了菌體的生長能力，進而提高了ε-PL產(chǎn)量。然而，流加酵母粉調(diào)控下的細胞中PEPC和CS酶活要高于pH調(diào)節(jié)策略，這樣就使得檸檬酸循環(huán)的代謝流更大，能夠為ε-PL合成提供更多的ATP和L-賴氨酸，最終流加酵母粉比pH調(diào)節(jié)使ε-PL產(chǎn)量提高11.8%。

圖2 不同策略調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵過程細胞活力的變化

圖3 不同策略調(diào)控ε-PL補料分批發(fā)酵過程關鍵酶活性變化

3 結論

針對補料分批發(fā)酵過程的中后期階段ε-PL產(chǎn)率下降的問題，本研究提出了調(diào)節(jié)pH和流加酵母粉兩種策略來改善細胞活性，以達到提高ε-PL產(chǎn)量的目的。利用上述兩種策略分別實現(xiàn)ε-PL產(chǎn)量達到36.95 g/L和41.32 g/L，較未經(jīng)調(diào)控補料分批發(fā)酵 (典型補料分批發(fā)酵) 分別提高了27.4%和42.5%。與此同時，利用CTC活細胞染色技術和關鍵酶活性監(jiān)測方法發(fā)現(xiàn)：典型ε-PL補料分批發(fā)酵過程溶氧上升和ε-PL產(chǎn)率下降是由細胞自身活力和初級代謝途徑關鍵酶活性下降引起的；兩種調(diào)控方法是從提高菌體細胞活力和初級代謝途徑關鍵酶活性角度達到促進ε-PL合成的效果。然而，是何原因引起細胞活力和關鍵酶活性下降仍需進一步研究。

REFERENCES

[1] Shih IL, Shen MH, Van YT. Microbial synthesis of poly (ε-lysine) and its various applications. Bioresour Technol, 2006, 97(9): 1148–1159.

[2] Yoshida T, Nagasawa T. ε-Poly-L-lysine: microbial production, biodegradation and application potential. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 62(1): 21–26.

[3] 關于批準ε-聚賴氨酸等4種食品添加劑新品種等的公告[EB/OL]. [2014-09-10]. http://www.nhfpc.gov.cn/sps/ s7890/201404/a93467d652c24a75a6de637abde31f30.shtml.

[4] Yoshimitsu H, Kazuya Y. Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature. 3rd ed. New York: Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2010: 45–60.

[5] Kahar P, Iwata T, Hiraki J, et al. Enhancement of ε-polylysine production bystrain 410 using pH control. J Biosci Bioeng, 2001, 91(2): 190–194.

[6] Shih IL, Shen MH. Application of response surface methodology to optimize production of poly-ε-lysine byIFO 14147. Enzyme Microb Technol, 2006, 39(1): 15–21.

[7] Jia SR, Wang GL, Sun YF, et al. Improvement of ε-poly-L-lysine production byTUST2 employing a feeding strategy//The 3rd International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering., Beijing, China[C]. 2009: 1–4. doi: 10.1109/ICBBE.2009.5162940.

[8] Liu SR, Wu Q, Zhang J, et al. Production of ε-poly-L-lysine bysp. using resin-based, in situ product removal. Biotechnol Lett, 2011, 33(8): 1581–1585.

[9] Chen XS, Tang L, Mao ZG, et al. Optimization of medium for enhancement of ε-poly-L-lysine production bysp. M-Z18 with glycerol as carbon source. Bioresour Technol, 2011, 102(2): 1727–1732.

[10] Chen XS, Li S, Liao LJ, et al. Production of ε-poly-L-lysine using a novel two-stage pH control strategy bysp. M-Z18 from glycerol. Bioprocess Biosyst Eng, 2011, 34(5): 561–567.

[11] Chen XS, Ren XD, Dong N, et al. Culture medium containing glucose and glycerol as a mixed carbon source improves ε-poly-L-lysine production bysp. M-Z18. Bioprocess Biosyst Eng, 2012, 35(3): 469–475.

[12] Li S, Chen XS, Dong C, et al. Combining genome shuffling and interspecific hybridization amongimproved ε-poly-L-lysine production. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 169(1): 338–350.

[13] Xu J, Chen YQ, Mao ZG, et al. Effect of acetic acid on citric acid fermentation in an integrated citric aicd-methane fermentation process. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 174(1): 376–387.

[14] Kahar P, Iwata T, Hiraki J, et al. Enhancement of ε-polylysine production bystrain 410 using pH control. J Biosci Bioeng, 2001, 91(2): 190–194.

[15] Zhang Y, Feng X, Xu H, et al. ε-poly-L-lysine production by immobilized cells ofsp. MY 5-36 in repeated fed-batch cultures. Bioresour Technol, 2010, 101(14): 5523–5527.

[16] Li Y. Principles and Technology of Fermentation Engineering. Beijing: Higher Education Press, 2007: 50–53 (in Chinese).李艷. 發(fā)酵工程原理與技術. 北京: 高等教育出版社, 2007: 50–53.

(本文責編陳宏宇)

Enhanced ε-poly-L-lysine production through pH regulation and organic nitrogen addition in fed-batch fermentation

Qixing Sun, Xusheng Chen, Xidong Ren, Gencheng Zheng, and Zhonggui Mao

Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

During the production ofε-poly-L-lysine (ε-PL) in fed-batch fermentation, the decline of ε-PL synthesis often occurs at middle or late phase of the fermentation. To solve the problem, we adopted two strategies, namely pH shift and feeding yeast extract, to improve the productivity of ε-PL. ε-PL productivity in fermentation by pH shift and feeding yeast extract achieved 4.62 g/ (L·d) and 5.16 g/ (L·d), which were increased by 27.3% and 42.2% compared with the control ε-PL fed-batch fermentation, respectively. Meanwhile, ε-PL production enhanced 36.95 g/L and 41.32 g/L in 192 h with these two strategies, increased by 27.4% and 42.48% compared to the control, respectively. ε-PL production could be improved at middle or late phase of fed-batch fermentation by pH shift or feeding yeast extract.

ε-poly-L-lysine, cell viability,sp. M-Z18, fed-batch fermentation

September 16, 2014; Accepted:November 26, 2014

Xusheng Chen. Tel: +86-510-85918279; E-mail: chenxs@jiangnan.edu.cn Zhonggui Mao. Tel: +86-510-85918279; E-mail: maozg@jiangnan.edu.cn

Supported by:Jiangsu Key Project of Scientific and Technical Supporting Program (No. BE2012616), the Cooperation Project of Jiangsu Province Among Industries, Universities and Institutes (No. BY2013015-11).

江蘇省科技支撐計劃(No. BE2012616)，江蘇省產(chǎn)學研前瞻性聯(lián)合研究項目 (No. BY2013015-11) 資助。