陶正生，王業(yè)民，鄭華亮，陶美鳳

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異源表達afsRS全局性調(diào)控基因提高工業(yè)菌株納他霉素產(chǎn)量

陶正生，王業(yè)民，鄭華亮，陶美鳳

上海交通大學生命科學技術學院微生物代謝國家重點實驗室，上海 200030

陶正生, 王業(yè)民, 鄭華亮, 等. 異源表達afsRScla全局性調(diào)控基因提高工業(yè)菌株納他霉素產(chǎn)量. 生物工程學報, 2015, 31(5): 744–751.Tao ZS, Wang YM, Zheng HL, et al. Improvement of natamycin production in an industrial strain by heterologous expression of the afsRScla global regulatory genes. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 744–751.

前期研究表明棒狀鏈霉菌的全局性調(diào)控基因afsRS異源表達可以激活變鉛青鏈霉菌中兩種抗生素的合成。本研究將包含afsRS基因的質(zhì)粒pHL851整合到納他霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株褐黃孢鏈霉菌TZ1401的基因組中，使納他霉素產(chǎn)量提高38%，達到3.56 g/L。qRT-PCR檢測6個納他霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄水平提高1.9?2.7倍，表明afsRS通過正調(diào)控納他霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高納他霉素的產(chǎn)量。本研究結(jié)果對afsRS在抗生素工業(yè)生產(chǎn)菌株的高產(chǎn)育種應用具有借鑒意義。

afsRS基因，工業(yè)菌株褐黃孢鏈霉菌TZ1401，納他霉素，發(fā)酵，qRT-PCR

納他霉素 (Natamycin) 又稱匹馬菌素 (Pimaricin)，是一種二十六元多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1][Aparicio, 1999 #1][Aparicio, 1999 #1]，具有很強的抗真菌活性，能特異性地抑制酵母菌和霉菌的生長[2]。目前發(fā)現(xiàn)的納他霉素產(chǎn)生菌主要有3種：納他鏈霉菌[3]，恰塔努加鏈霉菌[4]及褐黃孢鏈霉菌[5]。

納他霉素通過與真菌細胞膜上的甾醇化合物發(fā)生反應，改變細胞膜結(jié)構(gòu)，從而使細胞破裂，導致細胞死亡[6]。由于納他霉素對真菌作用的廣譜性，并具有良好的理化穩(wěn)定性及對人體無毒害，已被全球多個國家作為食品防腐劑批準使用。除了作為食品防腐劑廣泛應用于食品行業(yè)，納他霉素還被應用于臨床醫(yī)療，如治療真菌性角膜炎等[7]。納他霉素應用領域廣泛，但是較高生產(chǎn)成本是限制其廣泛使用的主要因素，因此提高納他霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本，有利于進一步推廣應用。

納他霉素生物合成基因簇含有19個開放閱讀框，其中包括2個途徑特異性調(diào)節(jié)基因 (和)、5個負責納他霉素聚酮骨架合成的聚酮合酶基因 (?) 和12個負責后修飾和其他功能的基因[1,8](圖1)。合成一種Ⅱ型硫脂酶，可能具有編輯校正功能，使納他霉素得以積累[9]。為GDP-甘露糖脫水酶，參與海藻糖胺糖部分的形成[10]；為糖基轉(zhuǎn)移酶，負責C-15位上甘露糖的轉(zhuǎn)移[11]。

鏈霉菌的次級代謝受到許多因素的影響，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的控制。AfsR是一種較早在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控蛋白，含有993個氨基酸，在其N端有SARP類家族的兩個特征結(jié)構(gòu)域，還含有可以結(jié)合ATP的保守基元[12]。AfsR是一個全局性調(diào)控因子，通過磷酸化介導的信號轉(zhuǎn)導作用將生理和環(huán)境信號進行整合，對多種抗生素合成具有調(diào)控作用[13]。蛋白激酶AfsK、PkaG和AfsL可以磷酸化AfsR[14]，AfsR蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化使AfsR的DNA結(jié)合能力增強。被磷酸化后AfsR可結(jié)合在緊鄰下游的啟動子區(qū)，從而啟動轉(zhuǎn)錄。天藍色鏈霉菌編碼64個氨基酸的小蛋白AfsS，雖然其功能尚未確定，但它的存在可以顯著增強放線紫紅素、鈣依賴抗生素和十一烷基靈菌紅素的合成[15]。本課題組陳黎等從棒狀鏈霉菌克隆得到afsRS，包含和兩個基因，發(fā)現(xiàn)afsRS不但可以提高棒狀鏈霉菌中克拉維酸的產(chǎn)量并激活沉默的全霉素的合成，同時還可以激活異源宿主變鉛青鏈霉菌中沉默的放線紫紅素和鈣依賴抗生素的產(chǎn)生[16]。本研究通過把全局性調(diào)控基因afsRS導入工業(yè)生產(chǎn)菌株褐黃孢鏈霉菌TZ1401中，考察afsRS對納他霉素生物合成基因轉(zhuǎn)錄的影響，通過基因工程的方法提高納他霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株的產(chǎn)量，獲得高產(chǎn)菌株。

圖1 褐黃孢鏈霉菌的納他霉素生物合成基因簇

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌ET12567/pUZ8002為大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移供體菌[17]，本實驗室保存。納他霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株褐黃孢鏈霉菌TZ1401由工廠提供。質(zhì)粒pSET152含接合轉(zhuǎn)移起始位點oriT、阿泊拉霉素抗性基因、放線菌噬菌體FC31整合位點以及整合酶基因[18]。pHL851為pSET152衍生質(zhì)粒，含有棒狀鏈霉菌afsRS基因，由Chen等構(gòu)建[16]。

1.1.2 主要試劑

DNA聚合酶及相關試劑購自TaKaRa公司；抗生素購自Sigma公司；其余試劑購自國藥集團或Oxoid公司。發(fā)酵納他霉素的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基粉末由納他霉素生產(chǎn)廠家提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物5，胰蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0，用于液體培養(yǎng)大腸桿菌。

2×YT培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物10，胰蛋白胨16，NaCl 5，pH 7.2，用于接合轉(zhuǎn)移時鏈霉菌孢子的熱激處理。

2CMY培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉10，胰蛋白胨2，NaCl 1，(NH4)2SO42，CaCO32，MgSO4·7H2O 2，K2HPO41，無機鹽溶液(1 mL)，瓊脂20，pH 7.2，用于褐黃孢鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移。其中無機鹽溶液(g/L)：FeSO4·7H2O 1，MgCl2·6H2O 1，ZnSO4·7H2O 1。

COM培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉10，燕麥粉5，麥芽提取物5，酵母抽提物2，瓊脂15，pH 7.2，用于褐黃孢鏈霉菌培養(yǎng)和產(chǎn)孢。

納他霉素種子培養(yǎng)基 (g/L)：種子培養(yǎng)基粉末43，pH 7.2。

納他霉素發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：發(fā)酵培養(yǎng)基粉末88.5，pH 7.2。

1.1.4 引物

用于PCR驗證重組菌株以及qRT-PCR的引物序列如表1所示，由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。引物afsRS-F、afsRS-R、Apr-F和Apr-R根據(jù)pHL851序列設計，兩對引物的序列分別位于阿泊拉霉素抗性基因和afsRS基因[16]，用于驗證pSET152和pHL851是否存在于重組鏈霉菌菌株。其他引物用于qRT-PCR，本研究中褐黃孢鏈霉菌納他霉素基因簇序列已部分測序，和納他鏈霉菌納他霉素基因簇序列 (基因序列號為AJ278573) 相同，qRT-PCR引物序列參考AJ278573序列，引物名稱與所擴增的基因名稱一一對應。

表1 本研究的引物及其核苷酸序列

1.2 方法

1.2.1 鏈霉菌與大腸桿菌屬間接合轉(zhuǎn)移

鏈霉菌與大腸桿菌屬間接合轉(zhuǎn)移參考文獻[17]。將酶切驗證正確的質(zhì)粒pHL851和空載質(zhì)粒pSET152分別電轉(zhuǎn)到ET12567/pUZ8002感受態(tài)細胞，獲得的轉(zhuǎn)化子ET12567/pUZ8002/pHL851和ET12567/pUZ8002/pSET152，經(jīng)過質(zhì)粒提取和酶切驗證正確后，作為接合轉(zhuǎn)移供體菌；褐黃孢鏈霉菌TZ1401作為受體菌。大腸桿菌和熱激后的鏈霉菌孢子混合后涂布2CMY平板，30 ℃倒置培養(yǎng)20 h后用阿泊拉霉素(終濃度50 μg/mL) 和三甲氧芐啶(終濃度50 μg/mL) 覆蓋，繼續(xù)培養(yǎng)直至接合轉(zhuǎn)移子長出。各隨機挑取12個形態(tài)正常的接合轉(zhuǎn)移子，在COM平板 (含50 μg/mL的阿泊拉霉素和25 μg/mL萘啶酮酸) 劃菌塊進行抗性驗證。選取抗性驗證正確的重組菌株TZ1401/pSET152和TZ1401/pHL851，提取總DNA，PCR驗證菌株含正確的質(zhì)粒。

1.2.2 褐黃孢鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵

將重組菌TZ1401/pSET152和TZ1401/pHL851在COM培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)孢，用1 mL藍色塑料槍頭粗口端打菌塊(約1 cm2/塊)，接種至30 mL種子培養(yǎng)基中(250 mL搖瓶)，在30 ℃、220 r/min振搖(5 cm振幅) 培養(yǎng)43 h。轉(zhuǎn)接3 mL種子培養(yǎng)物至25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL搖瓶)，30 ℃、220 r/min振搖(5 cm振幅) 繼續(xù)培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結(jié)束。

1.2.3 褐黃孢鏈霉菌發(fā)酵液的處理方法

納他霉素的提取：取發(fā)酵液0.5 mL加入到2 mL離心管中，7 000 r/min離心，棄上清，菌渣中加入1.5 mL 5%冰乙酸甲醇，充分打散后超聲處理20 min，7 000 r/min離心，取上清50 μL加入到950 μL 5%冰乙酸甲醇中，充分混勻后過濾，取150 μL于內(nèi)襯管中，進行HPLC檢測。

菌濃測定：取3 mL發(fā)酵液，7 000 r/min離心，收集菌體，稱量菌體；菌濃(g/mL)=菌體質(zhì)量/3。

1.2.4 檢測納他霉素產(chǎn)量的HPLC方法

色譜柱 (Agilent ZORBAX SB-C18 4.6 mm× 250 mm，5 μm)；色譜儀：Agilent1260；流動相：甲醇：水：冰乙酸(60：40：5)；流速：0.5 mL/min；檢測波長：303 nm；上樣量：10 μL。納他霉素標品(含量89.9%)，配制成0.1 mg/mL作為標準品對照；納他霉素發(fā)酵效價計算公式：發(fā)酵效價(g/L)=樣品峰面積/標準品峰面積×稀釋倍數(shù)×標準品濃度。

1.2.5 qRT-PCR分析基因表達量的方法

取在發(fā)酵培養(yǎng)基生長96 h的TZ1401、TZ1401/pSET152和TZ1401/pHL851各3個平行樣品發(fā)酵液，參照RNA提取試劑盒 (賽百盛基因公司) 說明書抽取菌體總RNA，殘余的基因組總DNA用DNaseⅠ進行消化。DNA消化后用Nanodrop (Thermo) 定量RNA的濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Fermentas) 說明書進行RNA的反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，選用6個具有代表性的納他霉素基因簇內(nèi)的基因進行qRT-PCR，以(基因序列號為X52983) 作為內(nèi)參基因。擴增程序：95 ℃預變性10 min；隨后95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40個循環(huán)。

qRT-PCR采用2–ΔΔCT相對基因表達分析方法[19]，以作為內(nèi)參基因。設計7個基因的qRT-PCR引物，擴增片段大小200 bp以內(nèi)，引物見表1。7個基因的qRT-PCR反應完成后的溶解曲線均呈現(xiàn)單一峰，擴增產(chǎn)物只有一條預期大小的目標條帶，說明7對引物均能特異擴增，沒有引物二聚體的形成，同時反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA也沒有受到基因組DNA污染。確保qRT-PCR數(shù)據(jù)具有可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1afsRS對工業(yè)菌株TZ1401生長的影響

將pSET152和pHL851分別接合轉(zhuǎn)移到褐黃孢鏈霉菌TZ1401，各隨機挑取12個接合轉(zhuǎn)移子，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)驗證菌株具有阿泊拉霉素抗性；再分別隨機挑取其中抗性正確的菌株提取總DNA，進行PCR驗證。PCR結(jié)果如圖2所示，TZ1401/pSET152重組菌(8株) 均可擴增出阿泊拉霉素抗性基因(345 bp)，但不能擴增afsRS基因(934 bp)；TZ1401/pHL851重組菌(7株) 則可以擴增出兩個基因。PCR表明質(zhì)粒pSET152和pHL851分別正確導入了TZ1401。把重組菌株TZ1401/pSET152和TZ1401/pHL851分別傳代培養(yǎng)，與出發(fā)工業(yè)菌株TZ1401對照觀察生長、產(chǎn)孢狀況，發(fā)現(xiàn)3種菌株單菌落形態(tài)基本相似，但是含有afsRS的菌株TZ1401/pHL851產(chǎn)氣生菌絲和孢子時間均有約12 h延遲，TZ1401/pHL851在第4天產(chǎn)白色氣生菌絲，第10天出現(xiàn)灰色孢子絲。

圖2 PCR檢測重組菌株的afsRScla (A) 和aac(3)Ⅳ (B)

2.2 afsRS對工業(yè)菌株TZ1401產(chǎn)量的影響

分別挑取TZ1401/pSET152和TZ1401/pHL851的3株平行菌株進行搖瓶發(fā)酵，工廠菌株TZ1401作為對照，每個菌株各重復發(fā)酵4瓶。在發(fā)酵結(jié)束后，測量菌體濃度 (圖3A)，TZ1401的平均菌濃為0.38 g/mL，TZ1401/pSET152菌濃略低于TZ1401，TZ1401/pHL851平均菌濃與TZ1401/pSET152相當，暗示菌濃改變系由載體引入菌株引起。HPLC檢測納他霉素發(fā)酵產(chǎn)量，結(jié)果見圖3B，工廠菌株TZ1401的納他霉素平均效價為2.58 g/L；導入空載質(zhì)粒pSET152的3株菌株納他霉素產(chǎn)量降低4%?10%；而導入含有afsRS的pHL851的3株重組菌的納他霉素產(chǎn)量平均效價達到(3.56±0.04) g/L，與出發(fā)工業(yè)菌株TZ1401比提高34%?40% (平均提高38%)，而與TZ1401/pSET152比則提高50%。

2.3 afsRS對工業(yè)菌株TZ1401納他霉素生物合成基因轉(zhuǎn)錄的影響

選取納他霉素基因簇內(nèi)6個基因進行轉(zhuǎn)錄水平分析，研究導入全局性調(diào)控基因afsRS對工業(yè)菌株TZ1401納他霉素生物合成基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。選取的6個基因包括調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因、、、和。前期實驗表明在96 h時，TZ1401納他霉素合成基因表達量達到最大值 (未發(fā)表)。因此選擇在發(fā)酵培養(yǎng)96 h時進行基因轉(zhuǎn)錄水平分析，考察6個基因在TZ1401、TZ1401/pSET152和TZ1401/pHL851三種菌株的相對轉(zhuǎn)錄水平。每個菌株平行發(fā)酵3瓶作為重復，qRT-PCR結(jié)果如圖4所示。導入空載質(zhì)粒pSET152對工業(yè)菌株TZ1401納他霉素基因簇的6個基因表達幾乎沒有影響，而導入pHL851后納他霉素基因簇的6個基因表達量都有提高，最低的有1.9倍的提高，最高的則有2.7倍的提高。表明納他霉素合成基因受到了全局性調(diào)控基因afsRS的正調(diào)控作用，這和納他霉素產(chǎn)量提高的結(jié)果是一致的，但是轉(zhuǎn)錄水平比產(chǎn)量提高的更多，可能因為次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量受到多種因素影響，比如前體物供應及翻譯效率等。

圖3 工業(yè)菌株TZ1401及含pSET152或pHL851的重組菌搖瓶發(fā)酵液的菌濃(A) 和發(fā)酵效價(B)

圖4 qRT-PCR分析afsRScla對納他霉素基因簇轉(zhuǎn)錄的影響

3 討論

在鏈霉菌中，是研究較清楚的與次級代謝相關的全局性調(diào)控基因，它首先在天藍色鏈霉菌中被發(fā)現(xiàn)，能夠引起A-因子、放線紫紅素和十一烷基靈菌紅素合成基因的高表達[20-21]。在波賽鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了的同源基因，過表達該同源基因時，能夠引起波賽鏈霉菌中阿霉素 (Doxorubicin)、變鉛青鏈霉菌中放線紫紅素、棒狀鏈霉菌中克拉維酸和灰色鏈霉菌中鏈霉素 (Streptomycin) 的高表達[22]，表明可能對多種鏈霉菌中的多種抗生素都有正調(diào)節(jié)作用。我們早期研究中發(fā)現(xiàn)來源于棒狀鏈霉菌的afsRS能夠激活變鉛青鏈霉菌沉默的放線紫紅素、鈣依賴性抗生素和棒狀鏈霉菌全霉素的生物合成，并大幅度提高克拉維酸的產(chǎn)量[16]。這是在野生型鏈霉菌中的情況。

本研究運用基因工程的方法改造了納他霉素工業(yè)菌株褐黃孢鏈霉菌TZ1401，把棒狀鏈霉菌的全局性調(diào)控基因afsRS導入到TZ1401中，搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)afsRS使納他霉素產(chǎn)量提高38%，表明對工業(yè)菌株的抗生素合成也具有促進作用。同時，qRT-PCR結(jié)果表明，含有afsRS的TZ1401/pHL851菌株納他霉素基因簇的6個代表性基因其轉(zhuǎn)錄水平都有2倍左右的提高，說明全局性調(diào)控基因afsRS通過正調(diào)控納他霉素基因簇的表達水平，從而提高納他霉素的產(chǎn)量。

在前人研究基礎上[15,23]，推測afsRS提高納他霉素合成的機理為：afsR產(chǎn)物AfsR被蛋白激酶磷酸化，磷酸化的AfsR的DNA結(jié)合能力和ATPase活性都增強，磷酸化的AfsR結(jié)合到下游的afsS的啟動子上形成封閉型的轉(zhuǎn)錄復合物，利用ATP水解釋放的能量，將封閉型的轉(zhuǎn)錄復合物轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放的轉(zhuǎn)錄復合物，從而誘導的轉(zhuǎn)錄，AfsS能夠激活調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，包括途徑特異性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，進而促進納他霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄，引起納他霉素的高產(chǎn)。

基因工程育種可以有目的地改造菌株，進行定向選育。隨著對菌株遺傳背景和代謝途徑的充分了解，基因工程育種勢必成為菌株選育重要手段。據(jù)本研究結(jié)果，全局性正調(diào)控基因afsRS可以應用于工業(yè)生產(chǎn)菌株，這對于使用afsRS來提高其他抗生素工業(yè)菌株的產(chǎn)量有重要借鑒意義。

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(本文責編陳宏宇)

Improvement of natamycin production in an industrial strain by heterologous expression of theafsRSglobal regulatory genes

Zhengsheng Tao, Yemin Wang, Hualiang Zheng, and Meifeng Tao

State Key Laboratory of Microbial Metabolism, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China

TheafsRSglobal regulatory genes fromactivate the production of two antibiotics in. In this study, we gained an increase of 38% in the production of natamycin (3.56 g/L) in an industrial strainTZ1401 through the integration of pHL851 that bears theafsRSglobal regulatory genes into its genome. We discovered by quantitive real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) that the expression of 6 genes of the natamycin biosynthetic gene cluster were improved from 1.9 to 2.7 times. This suggests thatafsRSimprove the production of natamycin through increased transcription. This study provides a good example for applyingafsRSin high yield breeding of industrial antibiotic producers.

afsRSglobal regulatory genes, industrial strainTZ1401, Natamycin, fermentation, quantitive real-time reverse transcription PCR

March 22, 2014; Accepted:May 5, 2014

Meifeng Tao. Tel: +86-21-62933765-2051; E-mail: tao_meifeng@sjtu.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31170084), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2010AA10A201).

國家自然科學基金(No. 31170084)，國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃) (No. 2010AA10A201) 資助。