基于氯霉素單克隆抗體的ELISA方法的建立

張立辰，生威，胡高爽，張燕，王碩（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

基于氯霉素單克隆抗體的ELISA方法的建立

張立辰，生威，胡高爽，張燕，王碩*
（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

摘要：旨在建立一種用于檢測(cè)海產(chǎn)品中氯霉素殘留的ELISA檢測(cè)方法。利用活化酯法將氯霉素半抗原連接到載體蛋白KLH上，制備氯霉素人工抗原，并免疫小鼠。通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選出一株能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株10A3B6E，經(jīng)小鼠體內(nèi)培養(yǎng)制備腹水并經(jīng)純化得到單克隆抗體。單克隆抗體的重鏈為IgG1，輕鏈為Kappa。通過(guò)對(duì)免疫分析方法工作條件的優(yōu)化，建立了一種簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用的檢測(cè)氯霉素的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。該方法IC50值為（0.54±0.04）ng/mL，IC15值為（0.10±0.03）ng/mL。該抗體與氯霉素琥珀酸鈉、甲砜霉素、氟甲砜霉素、鏈霉素的交叉反應(yīng)率分別為78%、0.09%、0.25%和0.05%，與四環(huán)素的交叉反應(yīng)率低于0.002%，說(shuō)明該抗體是一種高特異性抗體。利用所建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)鱈魚(yú)和蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，添加回收率在62.6%～120.0%之間，變異系數(shù)在0.94%～13.52%之間。本研究所建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度，可以用來(lái)對(duì)海產(chǎn)品中的氯霉素殘留情況進(jìn)行檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：氯霉素；海產(chǎn)品；獸藥殘留；單克隆抗體；直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

氯霉素是由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的培養(yǎng)液中提取出來(lái)的一種抗生素類(lèi)藥物，現(xiàn)主要用合成法生產(chǎn)[1]。氯霉素類(lèi)藥物具有吸收良好、價(jià)格便宜、抑菌性強(qiáng)和體內(nèi)分布廣泛等特點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物疾病防控[2]。但是，氯霉素在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中的過(guò)量使用會(huì)對(duì)食用者造成過(guò)敏、再生性障礙貧血、機(jī)體正常菌群失調(diào)和誘發(fā)癌癥等危害[3]。農(nóng)業(yè)部在2002年發(fā)布的第235號(hào)公告《動(dòng)物源性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規(guī)定禁止氯霉素在所有可食動(dòng)物中使用，在所有的可食動(dòng)物組織中，不得有氯霉素檢出。

目前，用于動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法[4]。除此之外，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法還有微生物法[5]、高效液相色譜法[6]、液相色譜電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]和免疫檢測(cè)方法[9-13]等。免疫檢測(cè)方法具有成本低、檢測(cè)時(shí)間短、易于操作、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，因而在實(shí)際生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用。本研究使用單克隆抗體技術(shù)，得到了一種高特異性的單克隆抗體，并利用該抗體建立了一種用于檢測(cè)海產(chǎn)品中氯霉素殘留的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。

1　材料與方法

1.1免疫動(dòng)物與細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雌性BALB/c小鼠：購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。骨髓瘤細(xì)胞為SP2/0細(xì)胞：教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑

氯霉素（CAP）標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)置于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；氯霉素琥珀酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、鑰孔嘁血藍(lán)蛋白（KLH）、辣根過(guò)氧化氫酶（HRP）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：均購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司；Free DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、青鏈霉素雙抗：均購(gòu)置于美國(guó)GIBCO公司；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒：購(gòu)置于美國(guó)Thermo公司；四氫呋喃：購(gòu)置于天津市化學(xué)試劑六廠；乙酸乙酯：購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3人工抗原的合成

1.3.1氯霉素半抗原與活化酯的合成

1.3.1.1氯霉素琥珀酸的合成

稱(chēng)取氯霉素琥珀酸鈉1.1 g，溶于3 mL去離子水中，用1 mol/L HCl調(diào)pH到2，可以見(jiàn)到溶液中有大量沉淀生成。收集沉淀，用去離子水洗滌，凍干，即可得到白色粉末狀氯霉素琥珀酸。

1.3.1.2氯霉素琥珀酸活化酯的合成

稱(chēng)取上步反應(yīng)制得的氯霉素琥珀酸423.2 mg、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）126.7 mg溶于20 mL無(wú)水四氫呋喃（THF）中，冰浴環(huán)境下攪拌0.5 h。將227.0 mg N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）溶于5 mL THF溶液，隨后加入到上述反應(yīng)體系中。冰浴下繼續(xù)攪拌1 h，撤掉冰浴，攪拌過(guò)夜。用硅膠柱分離目標(biāo)產(chǎn)物和其它雜質(zhì)（展開(kāi)劑，乙酸乙酯∶石油醚＝3∶1）。氯仿—石油醚重結(jié)晶，得到白色晶狀氯霉素琥珀酸活化酯固體。

1.3.2氯霉素免疫原的制備

將10 mg KLH載體蛋白溶于2 mL PBS中。稱(chēng)取制得的氯霉素活化酯1 mg，用100 μL DMF溶解。在冰浴條件下，將活化酯溶液緩慢加入到蛋白溶液中。4℃反應(yīng)16 h，反應(yīng)結(jié)束后4℃透析3 d[透析液為0.01 mol/L、pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）]，即可得到氯霉素免疫原，將免疫原置于-20℃下儲(chǔ)存。

1.3.3氯霉素酶標(biāo)抗原的制備

將2mg辣根過(guò)氧化物酶（HRP）溶于2mL、50mol/L的磷酸氫二鉀溶液中。稱(chēng)取氯霉素活化酯0.2 mg，用50 μL DMF溶解。在冰浴條件下，將活化酯溶液緩慢加入到蛋白溶液中。4℃反應(yīng)16 h，反應(yīng)結(jié)束后4℃透析3 d，即可得到氯霉素酶標(biāo)抗原，將酶標(biāo)抗原與等體積甘油混勻，置于-20℃下儲(chǔ)存。

1.4單克隆抗體的制備

1.4.1動(dòng)物免疫

將制備好的氯霉素免疫原用生理鹽水稀釋成1 μg/μL的溶液（質(zhì)量以載體蛋白的量計(jì)算），用等量弗氏完全佐劑制成油包水乳濁液。采用腹腔注射法免疫BALB/c小鼠，每只200 μL乳化劑（其中含有100 μg免疫原）。初次免疫后14 d進(jìn)行第二次免疫，劑量與初免相同，但佐劑換為弗氏不完全佐劑，以后每隔14天免疫1次，所用佐劑都為弗氏不完全佐劑。用間接ELISA法測(cè)定小鼠的抗血清效價(jià)與特異性，選擇抗血清效價(jià)高、特異性強(qiáng)的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。在第三次免疫完成后的14 d內(nèi)進(jìn)行沖刺免疫，免疫前不需乳化，但免疫原量加倍，沖刺免疫后3 d進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4.2細(xì)胞融合與篩選

取出小鼠的脾臟，將小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。融合后的細(xì)胞加入96孔板中，用含有HAT的培養(yǎng)基培養(yǎng)。用間接ELISA法篩選出能夠特異性分泌氯霉素抗體的細(xì)胞。用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，得到能夠穩(wěn)定分泌氯霉素抗體的雜交瘤細(xì)胞株。1.4.3單克隆抗體的大量制備與純化

選取10周齡大的Balb/c小鼠，將石蠟油注入小鼠腹腔中。7 d后將篩選得到的細(xì)胞株接種到小鼠腹腔中制備腹水，收集的腹水4 000 r/min下離心10 min，除去脂肪、纖維和細(xì)胞，收集中層的液體，-20℃下儲(chǔ)存。腹水采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化。

1.5抗體的亞型鑒定

使用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒（Therm，USA）對(duì)細(xì)胞株所產(chǎn)抗體進(jìn)行亞型鑒定。

1.6直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的操作步驟

將氯霉素單克隆抗體用包被緩沖液稀釋?zhuān)悦靠?00 μL（抗體0.01 μg/孔）的體積加入到96孔酶標(biāo)板中。將酶標(biāo)板放置于4℃條件下過(guò)夜。第二天棄去孔中液體，用PBST清洗板孔3次，拍干；每孔加入200 μL封閉液（0.5%脫脂乳粉），37℃下孵育1 h，棄去孔中液體，洗板3次，拍干；每孔加入50 μL稀釋到一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）和50 μL的酶標(biāo)抗原，以加入50 μL PBS和50 μL酶標(biāo)抗原的孔作為對(duì)照，只加入100 μL PBS的孔作為空白，37℃孵育1 h，洗板3次，拍干；每孔加入100 μL顯色液，37℃顯色15 min后，每孔加入50 μL終止液終止顯色反應(yīng)。在雙波長(zhǎng)方式（450 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，650 nm為參比波長(zhǎng)）下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值。

1.7樣品稀釋液離子強(qiáng)度和pH的優(yōu)化

分別使用0.01、0.03 mol/L和0.05 mol/L的PBS （pH 7.4）作為樣品稀釋液，建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，選擇方法IC50值較低，且ODmax值（對(duì)照孔的吸光度值）較為適宜的PBS濃度。

在相同離子強(qiáng)度的前提下，分別使用pH為5.7、7.4和8.5的PBS作為樣品稀釋液，建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，選擇方法IC50值較低，且ODmax值較為適宜的pH的PBS。

1.8抗體交叉反應(yīng)性的測(cè)定

使用3種氯霉素的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物（氯霉素琥珀酸鈉、甲砜霉素、氟甲砜霉素）和兩種其它獸藥（鏈霉素、四環(huán)素）代替氯霉素用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并分別計(jì)算其IC50值。交叉反應(yīng)率計(jì)算公式如下：

1.9樣品處理

稱(chēng)取2 g均質(zhì)過(guò)的樣品（鱈魚(yú)或?qū)ξr），加入6 mL乙酸乙酯，震蕩1 min，4 729 r/min離心20 min。取3 mL上清液，60℃下氮?dú)獯蹈伞? mL PBS（0.05 mol/L，pH5.7）復(fù)溶殘余物，用于ELISA檢測(cè)。

1.10添加回收率的測(cè)定

向鱈魚(yú)、對(duì)蝦樣品中分別添加10、30、100 ng/g的氯霉素，用以上優(yōu)化好的方法處理樣品后，用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)樣品中氯霉素的含量并計(jì)算相應(yīng)的回收率。

2　結(jié)果與討論

2.1小鼠抗血清效價(jià)與特異性測(cè)定

經(jīng)過(guò)3次免疫，小鼠體內(nèi)抗血清的效價(jià)都能達(dá)到1∶64 000。從中選擇抗血清特異性最強(qiáng)的小鼠，進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

2.2單克隆抗體細(xì)胞篩選

經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合與篩選，最終得到一株既能穩(wěn)定分泌氯霉素單克隆抗體、又能無(wú)限增殖的雜交瘤細(xì)胞10A3B6E。細(xì)胞上清液特異性測(cè)定對(duì)100 ng/mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品抑制率為91%。

2.3單克隆抗體亞型鑒定

經(jīng)單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定，細(xì)胞株10A3B6E所產(chǎn)單克隆抗體重鏈亞型為IgG1，輕鏈亞型為Kappa。

2.4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液離子強(qiáng)度和pH的優(yōu)化

分別使用3種不同離子強(qiáng)度的PBS作為稀釋液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立見(jiàn)表1。

表1　稀釋液離子強(qiáng)度的優(yōu)化Table 1　Optimization of ionic strength of assay buffer

如表1，不同濃度的PBS對(duì)ODmax的影響不大，但用0.05 mol/L的PBS建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)IC50值最低，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用該種PBS。

在0.05 mol/L的濃度下，分別使用3種不同pH的PBS作為稀釋液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立見(jiàn)表2。

表2　稀釋液pH的優(yōu)化Table 2　Optimization of pH of assay buffer

如表2，不同pH的PBS對(duì)ODmax的影響不大，但用pH 5.7的PBS建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)IC50值最低，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用該種PBS。

2.5氯霉素ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以氯霉素濃度的對(duì)數(shù)值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的橫坐標(biāo)，以抑制率作為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，如圖1所示。

圖1　氯霉素直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)Fig.1　Standard inhibition curve of ELISA for chloramphenicol

IC50值為（0.54±0.04）ng/mL、IC15值為（0.10±0.03）ng/mL。

2.6抗體交叉反應(yīng)性

抗體交叉反應(yīng)的結(jié)果如表3所示。

表3　氯霉素抗體與其它獸藥的交叉反應(yīng)Table 3　Cross-reactivity of chloramphenicol monoclonal antibody with other veterinary drugs

該單克隆抗體與氯霉素琥珀酸鈉有較大的交叉反應(yīng)，這是由于半抗原是用氯霉素琥珀酸鈉合成的。而抗體與其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物：氟甲砜霉素、甲砜霉素交叉反應(yīng)較小，與其他常用獸藥鏈霉素、四環(huán)素并無(wú)交叉反應(yīng)。說(shuō)明該單克隆抗體對(duì)氯霉素有很好的特異性。

2.7添加回收實(shí)驗(yàn)

將3種不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加到鱈魚(yú)與對(duì)蝦樣品中，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表4。

表4　ELISA檢測(cè)樣品中氯霉素含量的回收率Table 4　Recoveries of chloramphenicol in spiked samples by ELISA

如表4所示，添加回收率在62.6%～120%之間，變異系數(shù)在0.94%～13.52%之間，方法具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度。

3　結(jié)論

氯霉素相對(duì)分子質(zhì)量為323.13，是一種小分子物質(zhì)。本身不具有免疫原性，必須與大分子載體蛋白連接才能在動(dòng)物體內(nèi)形成免疫應(yīng)答。本研究將氯霉素的衍生物氯霉素琥珀酸鈉用鹽酸酸化形成羧基末端，制備半抗原氯霉素琥珀酸。利用活化酯法將半抗原與載體蛋白KLH偶聯(lián)制備人工免疫原。免疫原免疫小鼠后，利用雜交瘤技術(shù)，制得氯霉素單克隆抗體。使用該單克隆抗體建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，IC50值為（0.54±0.04）ng/mL，IC15值為（0.10±0.03）ng/mL?？贵w與合成半抗原的原料氯霉素琥珀酸鈉有交叉反應(yīng)，與其余幾種常用獸藥交叉反應(yīng)很小，特異性較好。通過(guò)對(duì)鱈魚(yú)、對(duì)蝦兩種基質(zhì)的樣品檢測(cè)可以看出，方法有很好的準(zhǔn)確性。所建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法可以應(yīng)用于海產(chǎn)品中氯霉素殘留的檢測(cè)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.033

收稿日期：2014-07-16

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAD28B05）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（11ZCGHHZ01100）

作者簡(jiǎn)介：張立辰（1988—），男（漢），碩士，研究方向：食品安全檢測(cè)。*通信作者：王碩（1969—），教授，博導(dǎo)，研究方向：食品安全和免疫學(xué)檢測(cè)。

Study on An Enzyme Linked Immunosorbent Assay Based on A Monoclonal Antibody for the Detection of Chloramphenicol

ZHANG Li-chen，SHENG Wei，HU Gao-shuang，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，The School of Food Engineering and Biological Technology Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：The aim of this research was to develop an ELISA to detect chloramphenicol in marine products.The chloramphenicol succinate was conjugated to keyhole limpet hemocyanin by activated ester method to prepare the immunogen for immunizing mices.Through a hybridoma cell line，a strain of cells which can produce antichloramphenicol monoclonal antibody was obtained.Ascites was produced by mice vivo culcure and purified to obtain monoclonal antibody.The heavy chain of the antibody was IgG1，and the light chain was Kappa.A direct competitive ELISA using above-mentioned monoclonal antibody was developed for the detection of chloramphenicol by optimizing the working conditions of assay.The IC50value was（0.54±0.04）ng/mL，IC15value was（0.10±0.03）ng/mL.Cross-reactivities with chloramphenicol sodium succinate，thiamphenicol，florfenicol，streptomycin and tetracycline were 78%，0.09%，0.25%，0.05%and＜0.002%respectively，which indicated that the assay had high specificity.The recoveries for chloramphenicol from cod and shrimp samples were ranged from 62.6%to 120%and the coefficients of variation were between 0.94%-13.52%.The ELISA allows for a rapid，sensitive，specific，accurate，and low-cost determination of chloramphenicol residues in marine products.

Key words：chloramphenicol；marine products；veterinary drug residues；monoclone antibody；direct competitive ELISA