韓煥美，何桂華，張愛霞，鄭新華，陳晞，李曉明（濟南出入境檢驗檢疫局，山東濟南250014）

面粉及面制品中過氧化苯甲酰的檢測誤區(qū)

韓煥美，何桂華*，張愛霞，鄭新華，陳晞，李曉明
（濟南出入境檢驗檢疫局，山東濟南250014）

摘要：建立了高效液相色譜法同時檢測面粉及面制品中過氧化苯甲酰和苯甲酸的方法。采用Waters XTerra RPC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.4%乙酸水溶液（60/40，體積比）為流動相；以1.0 mL/min的流速檢測苯甲酸和過氧化苯甲酰（λ=230 nm）。在0.125 μg/mL～100 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，最低檢出限為0.5 mg/kg，加標回收率在90.8%～105%。模擬面粉的儲存和熟制過程，發(fā)現(xiàn)面制品制備、熟化的過程中，過氧化苯甲酰能快速降解，熟制面制品中基本不能檢測出過氧化苯甲酰，而且面制品在植物油中油炸，油脂中添加的抗氧劑與過氧化苯甲酰相互作用，生成可能有毒有害成分?？傊?，單純檢測面粉及面制品中的過氧化苯甲酰對保證面粉及面制品的質(zhì)量是不恰當?shù)摹?/p>

關(guān)鍵詞：過氧化苯甲酰；降解；抗氧化劑

過氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide，BPO）作為一種食品添加劑主要用來使小麥粉增白，俗稱面粉增白劑。國際食品法典委員會與美國食品和藥物管理局（FDA）對BPO作為小麥粉處理劑的作用解釋是：后熟、漂白和防止霉變[1]。BPO的作用機理：在面粉中水和酶的作用下發(fā)生反應(yīng)，釋放出活性氧以氧化面粉中極少數(shù)帶共軛雙鍵的不飽和脂溶性色素即β-胡蘿卜素和其他有色成分，使面粉中色素含量變少，白度增加，同時生成的苯甲酸，對面粉起防霉作用，此外對面粉還具有后熟作用[2-4]。BPO的風險目前仍有爭議，歐盟、FDA和聯(lián)合食品添加劑專家委員會等所依據(jù)的研究結(jié)果和科學事實是一致的，不同只在于對于其風險的評估和接受程度的差異。研究證實，過量食用BPO主要的危害包括破壞食品中的營養(yǎng)素，損害肝功能并能導(dǎo)致膽結(jié)石，BPO還是腫瘤發(fā)生的促進劑[4]。羅文海[5]等研究了不同濃度級別的BPO能明顯降低血清睪酮的含量，它是大鼠雄性生殖功能的危險因素；BPO的劑量愈大，其降低血清乳酸脫氫酶含量的作用愈大，而血清乳酸脫氫酶也是測量雄性生殖功能的常用指標。張慶鳳等[6-10]研究發(fā)現(xiàn)BPO可能降低大鼠的生殖功能和導(dǎo)致脾臟等臟器功能損傷，致癌性較高。因此，食品安全國家標準（GB 2760-2011）中將BPO從面粉處理劑的名單中剔除，并規(guī)定自2011年5月1日起面粉中禁止添加BPO。

目前，BPO的檢測方法已經(jīng)十分成熟，主要有高效液相色譜法（HPLC）、毛細管電泳法、氣相色譜法、間接碘量法、紫外分光光度法等[11-12]，本實驗室采用HPLC。自2010年至2013年6月30日，本實驗室共檢測BPO項目279批次，涉及十余種面粉制品見圖1。

圖1　近四年過氧化苯甲酰檢測批次、樣品類別及所占比例Fig.1　The total batch of BPO detection，classification and sample proportion in nearly four years

從圖1可以看出，BPO檢測種類、批次是逐年上升的，檢出率均為0，但是，這并不能說明消費者日常食用的米面制品是沒有添加BPO的。究其原因，可能有如下幾點：1）本實驗室檢測的面粉及面粉制品是“綠色的”，沒有添加BPO的（從統(tǒng)計學角度講，這種可能性比較?。?；2）添加的BPO與面粉的營養(yǎng)物質(zhì)[13-15]（比如維生素、類胡蘿卜素）發(fā)生化學反應(yīng)生成其他產(chǎn)物；3）面粉及面制品中BPO受周圍環(huán)境（如溫度、光照等）的影響，降解成其他成分。從BPO的分子結(jié)構(gòu)、化學性質(zhì)、改良/漂白面粉制品的作用原理等方面推測，BPO的產(chǎn)物之一是苯甲酸。添加到面粉中的BPO由于受周圍環(huán)境影響而發(fā)生降解，但是其殘留量、降解產(chǎn)物、降解規(guī)律等尚不明確，本文將針對這些問題開展研究。

1　材料與方法

1.1試劑材料與儀器設(shè)備

乙腈（色譜純）：默克化工技術(shù)有限公司；冰乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；苯甲酸標準品（1 000 μg/mL）：中國計量科學研究院；BPO標準品（純度為98.0%）：上海安譜科學儀器有限公司；小麥粉；水：Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；BPO（化學純）：上海中利化工廠助劑分廠。Agilent1260液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、Agilent1100液相色譜儀（配有熒光檢測器）：美國安捷倫公司；分析天平（感量為0.1mg）：梅特勒-托利多公司；Milli-Q純水器：美國Millipore公司；IKA-KS130型振蕩器：德國IK公司；色譜柱：Waters XTerra RP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2液相色譜分離條件

流動相：乙腈∶H2O（含體積分數(shù)0.4%的冰乙酸）為60∶40（體積比）；流速：1 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：230 nm；進樣體積：10 μL。

1.3標準溶液配制

BPO標準溶液：精密稱取BPO粉劑0.010 2 g置10 mL量瓶中，加乙腈適量使溶解，再加乙腈稀釋至刻度，搖勻，使其濃度為1 000 μg/mL。

苯甲酸、BPO標準曲線：精確移取不同體積的標準溶液于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻。制成質(zhì)量濃度為 0、0.125、0.25、0.5、1、2、10、20、50、100μg/mL混合標準溶液系列。在設(shè)定色譜條件下，分別取10 μL進行HPLC分析，對照品苯甲酸、BPO及其混合溶液的色譜圖如圖2。

圖2　苯甲酸和BPO的對照品色譜圖Fig.2　Standard chromatograms of benzoic acid and BPO

1.4小麥粉前處理及測定

精密稱取樣品約5.00 g（粉末樣品直接稱取，固體樣品需粉碎），加入20 mL乙腈，振蕩40 min，靜置，取上清液過0.45 μm濾膜后上機檢測。

1.5儲存環(huán)境和熱加工對BPO殘留量的影響

小麥粉添加約240 mg/kg的BPO試劑，攪拌均勻。將面粉放置在光照通風處儲存（25℃，濕度50%），每隔1小時取3平行樣，前處理后HPLC檢測。將該面粉加水拌勻，發(fā)酵30 min后，去一半定型蒸熟；另一半于油脂中煎炸。冷卻后，分別取樣3平行，前處理后入HPLC檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1苯甲酸、BPO的標準曲線及最低檢出限

苯甲酸的線性方程為y=55.772 96x+14.354 28，相關(guān)系數(shù)r=0.999 90；BPO的線性方程為y=54.471 26x+ 8.826 20，相關(guān)系數(shù)r=0.999 97。線性范圍均為0.125 μg/ mL～100 μg/mL；最低檢出限為0.5 mg/kg。將不同質(zhì)量濃度的對照品色譜吸收峰的面積及對應(yīng)保留時間歸納至表1。

表1　不同質(zhì)量濃度的苯甲酸和BPO對照品色譜吸收峰的面積及對應(yīng)保留時間Table 1　Absorption peaks’area and the corresponding retention time at different concentrations of standard benzoic acid and BPO

2.2溫度對小麥粉中BPO殘留量的影響

將準確稱量的化學純BPO粉劑于50 mL燒杯中，加入一定量乙腈溶解，然后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，定容，質(zhì)量濃度約為60 mg/mL，4℃儲備待用。量取一定體積的BPO儲備液于具塞圓底燒瓶中，加入乙腈稀釋，其質(zhì)量濃度約60 μg/mL。將其放置在60℃水浴中，每隔30 min取一次樣液，冷卻后過濾膜進行HPLC檢測。選擇水浴2 h時的乙腈溶液進行HPLC檢測，能夠有力證明BPO在乙腈溶液中的穩(wěn)定性，如圖3。

圖3　化學純添加劑BPO的色譜圖Fig.3　Chromatograms of chemical additives of pure BPO

從圖上不難看出，有6個色譜峰，保留時間分別為，3.26、3.62、4.40、10.63、12.22、14.93 min，其中3.62、 10.63min的吸收峰對應(yīng)的是苯甲酸和BPO。在整個過程中，各個色譜吸收峰的面積及峰高變化較小，說明BPO在有機溶劑中有良好的熱穩(wěn)定性。但是，添加在食品中的BPO的實際環(huán)境是水相的，為此，本文將研究BPO在水相中的穩(wěn)定性。

同樣的，吸取一定體積的BPO儲備液于敞口三角瓶中，加水稀釋，使其質(zhì)量濃度約為60 μg/mL。為了更接近實際，將三角瓶置于沸水中，每5 min取樣一次，冷卻后進行HPLC檢測，截取15 min和35 min樣液色譜圖如圖4A。

圖4　沸水浴中不同時間段BPO溶液的色譜圖（A）和苯甲酸-BPO吸收峰面積（B）的變化趨勢Fig.4　BPO chromatogram at different time in a boiling water bath solution and benzoic acid（A）and BPO absorption-peak-area’（B）change trend

從圖4A不難看出，BPO的水溶液在沸水浴15min 和35 min時的色譜圖有明顯不同，主要表現(xiàn)在3.26和3.62 min的吸收峰有明顯增強，10.63 min的吸收峰消失。以苯甲酸和BPO的峰面積為縱坐標，以水浴時間為橫坐標作圖，得苯甲酸和BPO的濃度變化趨勢（圖4B）。分析苯甲酸吸收峰面積的變化趨勢，可以推測，既使食用添加了BPO面粉及其制品，“入口”的可能已無BPO，但一定含有苯甲酸，這與張帆[17]等模擬的BPO熱分解動力學結(jié)論基本一致?？傊?，在熟制面制品中檢測BPO項目是不恰當?shù)摹８鶕?jù)BPO吸收峰面積的變化趨勢可知，即使面粉中添加了一定量BPO（最大使用量60 mg/kg），在其熟制過程中，BPO能完全降解，擔心BPO會危害人體健康是不必要的。

2.3儲存環(huán)境和熱加工對BPO殘留量的影響

分析BPO的分子結(jié)構(gòu)可知，即使在新鮮小麥粉中添加了一定量的BPO，受光照、空氣、濕度等因素的影響，BPO自然降解一段時間，消費者實際購買到的面粉中可能已經(jīng)不含BPO。為此，本人又模擬了面粉的儲存和熱加工過程，樣品按照上文的前處理方法處理后進行HPLC檢測，苯甲酸和BPO峰面積的變化趨勢如圖5。

圖5　面粉在儲存（A）和熱加工熟制（B）過程中苯甲酸和BPO的變化趨勢Fig.5　Trend of benzoic acid and BPO absorption-peak area in wheat flour within thermal processing

回收率在90.8%～105%。面粉儲存過程中，苯甲酸和BPO含量的變化比較平緩，基本成線性；熱加工過程中，苯甲酸和BPO的面積相對較小，應(yīng)該是加了水分稀釋了的緣故，BPO吸收峰面積基本成線性下降，這很容易理解，苯甲酸吸收峰面積成拋物線趨勢變化，應(yīng)該是部分苯甲酸溶解在水中的緣故。

2.4抗氧化劑對BPO殘留量的影響

BPO是強氧化劑，油脂中的抗氧化劑，比如特丁基對苯二酚是還原劑，二者會發(fā)生什么反應(yīng)呢？實際上，本人認為添加了過氧化苯甲酰的面粉制備油炸食品危害消費者健康的可能性較大，因為特丁基對苯二酚的氧化產(chǎn)物對人體的危害大大高于特丁基對苯二酚本身。為了探索BPO和特丁基對苯二酚的相互作用，將添加了已知濃度的BPO面粉在油（添加了已知濃度的特丁基對苯二酚）中煎炸，分別檢測面制品中的苯甲酸及BPO和油脂中TBHQ的含量（依據(jù)GB/T 21927-2008《食品中叔丁基對苯二酚的測定高效液相色譜法》），結(jié)果如圖6。

圖6　油炸面片中BPO與苯甲酸的色譜圖（A）和油脂中特丁基對苯二酚的色譜圖（B）Fig.6　Chromatogram of BPO and benzoic acid in fried food（A）and of tert-butyl hydroquinone in oil（B）

油脂中特丁基對苯二酚的濃度降低了32.3%，加標回收率為101%；油炸面片中的BPO濃度降低了74.2%，苯甲酸濃度增加了106%，回收率分別為99.3%、91.6%。這些數(shù)據(jù)說明BPO和特丁基對苯二酚之間發(fā)生了氧化還原反應(yīng)。

3　討論與結(jié)論

在試驗過程中，發(fā)現(xiàn)以下幾個問題：1）分析苯甲酸和BPO對照品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度梯度出現(xiàn)幾個未知峰（表1）；2）BPO在水溶液中的濃度變化是分階段成線性關(guān)系下降，但是苯甲酸的濃度在上升到一定濃度后基本保持不變，可能是因為苯甲酸部分揮發(fā)（圖4）；3）面粉熱加工的過程中，苯甲酸的濃度呈拋物線狀，可能是因為BPO分解產(chǎn)物苯甲酸溶解在水中的緣故，這也可能是苯甲酸加標回收率偏低的原因之一（圖5）；4）油脂食品中，BPO色譜圖（圖6A）中出現(xiàn)了許多未知峰；特丁基對苯二酚色譜圖（圖6B）出現(xiàn)了2個未知峰。分析數(shù)據(jù)，可得出以下結(jié)論：1）BPO屬亞穩(wěn)態(tài)化合物，受光照、空氣、濕度等影響自身降解為苯甲酸，也有可能與面粉的營養(yǎng)成分比如維生素反應(yīng)，自身被還原為苯甲酸（主要產(chǎn)物）；2）經(jīng)過熱加工的面制品，BPO殘留量很低或已經(jīng)消除；3）BPO可與油脂中的抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)?？傊?，面制品在儲存和熱加工過程中，BPO是很難穩(wěn)定存在的，其降解規(guī)律，我們或許已窺得一二；但是，BPO與油脂中的抗氧化劑發(fā)生何種反應(yīng)，生成何種產(chǎn)物，對人體健康的危險程度，還需要進一步的探索。

分析上文的數(shù)據(jù)，不難發(fā)現(xiàn)，既使面粉中添加了BPO，在實際檢測過程中，以BPO為目標產(chǎn)物檢測面粉或面制品中的BPO是不合適。首先，BPO的分子結(jié)構(gòu)決定了其化學不穩(wěn)定性，熱、光、水等因素都是其分解的誘因；其次BPO作為面粉處理劑的作用機理也佐證了面粉及面制品中BPO能與面粉中的維生素發(fā)生反應(yīng)，自身被還原成苯甲酸，這意味著BPO的含量不是恒定不變的；最后，由于油脂中抗氧化劑的普遍使用，BPO、抗氧化劑、油脂中的不飽和酸、面粉中的維生素等可能發(fā)生一系列復(fù)雜的化學反應(yīng)，且不論生成的某種化合物是否具有生物毒性，部分BPO一定被還原成苯甲酸?？傊?，以BPO為目標物，定性或定量檢測面粉，尤其是面制品中BPO的添加量是不恰當?shù)摹?/p>

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.037

收稿日期：2014-03-20

基金項目：山東出入境檢驗檢疫局科技項目（SK201358）

作者簡介：韓煥美（1983—），女（漢），工程師，博士，研究方向：食品添加劑檢測。

*通信作者

Detecting Defect of Benzoyl Peroxide in Wheat Flour and Flour Products

HAN Huan-mei，HE Gui-hua*，ZHANG Ai-xia，ZHENG Xin-hua，CHEN Xi，LI Xiao-ming
（Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jinan 250014，Shandong，China）

Abstract：A new method had been established to determine the benzoyl peroxide（BPO）and benzoic acid in wheat flour and its products in a rapid and accurate way by high performance liquid chromatography.Waters XTerra RP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）chromatographic column and the mobile phase of mixture of acetonitrile and water including 0.4%acetic acid（60/40）at 1 mL/min were used for the separation.UV-detection at 230 nm was adopted in measurements.The benzoyl peroxide and benzoic acid were shown to be linear in the range from 0.125 μg/mL to 100 μg/mL，and the limits of detection were 0.5 mg/kg.The recovery of the method was between 90.8%and 105%.Next，the processes of the storage and ripening of wheat flour had been simulated to know degradation law of BPO.The results indicated that the measurement of BPO in wheat flour products was not suited.In one side，BPO can be deoxidized to be benzoic acid and others by heated.In another side，it is too difficult to protect BPO from reacting with antioxidant in fried food prepared.In a word，there are defects in BPO measurements of wheat flour and its products，and it is working key in our experiment.

Key words：benzoyl peroxide；degradation；antioxidant