任敏　吳羽晨　張家洋等

摘要：以金銀花的葉片為外植體，在50組不同濃度IAA、NAA、6-BA組合的MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)，以探討金銀花的快速繁殖體系的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，IAA和NAA的最佳濃度均為1.0 mg/L，6-BA的最佳濃度為 15 mg/L。確定適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。

關(guān)鍵詞：愈傷組織；金銀花；組織培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基；配方；IAA；NAA；6-BA；最佳濃度

中圖分類號： S567.7+90.43 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0038-03

金銀花（Lonicera japonica Thunb）別稱銀花、雙花、忍冬、二寶花，是忍冬科忍冬屬多年生半常綠木質(zhì)藤本植物[1-2]。金銀花單葉對生，葉片卵形或長卵形，兩面被柔毛；每葉腋內(nèi)由二花組成一小聚傘花序，花兩側(cè)對稱，花冠唇形，初開時為白色，2～3 d后變成金黃色，故名金銀花[3]，花期為4—6月。金銀花喜溫暖濕潤氣候，適應(yīng)性比較強，對土壤要求不嚴，耐寒、耐旱、耐澇，除東北、西北等高寒、干旱地區(qū)和海南外，全國各地均有分布。金銀花全草均可入藥，其主要藥用成分是綠原酸和異綠原酸，具有清熱解毒、除火、消炎等多種功效，主治溫病、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、痛腫潰瘍、痢疾、丹毒、肺炎等癥[4]。金銀花的花蕾含有揮發(fā)性芳香油、皂苷、綠原酸、肌醇和黃酮類化合物等，還含有肉桂酸、茉莉醛、橙花醇等；其莖中含有生物堿；其葉中含有忍冬苷、忍冬素和木樨素等。根據(jù)藥理研究，金銀花對大腸桿菌、痢疾桿菌、葡萄球菌和肺炎雙球菌等有抑制作用[5-6]，是我國著名的豫產(chǎn)道地中藥材之一。尤其是在2003年的“非典”時期，以金銀花為重要成分的中草藥對“非典”的預(yù)防作用十分顯著。金銀花除了作為用途廣泛的中藥材外，還具有良好的保健作用。此外，金銀花茶香氣宜人，對防治盛夏中暑、風(fēng)熱感冒、上呼吸道感染和腸胃疾病有良好的效果，可以制作飲料。尤其是對清除人體自由基、提高人體免疫機能和延緩衰老等具有良好的作用，因而也是高血壓和心血管系統(tǒng)患者降低膽固醇的保健佳品。金銀花花開清香宜人，黃白相間，繁華密布，也是優(yōu)良園林綠化植物。目前，金銀花仍采用傳統(tǒng)的扦插和壓條2種繁育方式[7]，但這些傳統(tǒng)的繁殖方式繁殖速度慢、繁殖系數(shù)低，繁殖的苗木規(guī)格不一，商品化程度不高，不能滿足金銀花優(yōu)良品種迅速推廣種植的需要，因此，如何提高其繁殖速度，增加繁殖系數(shù)，并使其迅速推廣種植已成為金銀花生產(chǎn)中亟待解決的一個重要問題。而國內(nèi)外對金銀花的研究多集中在栽培、管理、加工、藥理、制劑等方面，關(guān)于其組織培養(yǎng)、離體快繁的研究[8-9]卻報道得極少，僅見有鳳爪金銀花[10]和蒙花1、2號金銀花[11]的組培報道，但封丘金銀花組培還未見有報道。本試驗以新鄉(xiāng)學(xué)院校園內(nèi)的封丘金銀花品種的葉片為外植體，在不同濃度的MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)，通過對照不同的激素組合，以探索金銀花的愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件，為金銀花的快速繁殖和充分利用打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇

從新鄉(xiāng)學(xué)院校園內(nèi)采集健壯的封丘金銀花幼莖，剪取葉片為外植體進行培養(yǎng)。取材時間為3月中旬至4月下旬。

1.2 試驗方法

1.2.1 配制培養(yǎng)基

試驗以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以不同的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合共設(shè)計采用了50組愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基M1～M50：MS+（0.1～1.5） mg/L IAA/NAA+（0.1～2.0） mg/L 6-BA（表1），每組做3個對照。所有培養(yǎng)基均添加3%蔗糖、0.65%瓊脂，調(diào)至pH值至5.8，分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶25 mL，封口后在121 ℃條件下滅菌20 min，并且將重蒸水、鑷子、打孔器、濾紙用聚丙烯薄膜包裝后一并滅菌[12]。待培養(yǎng)基冷凝后，放入超凈工作臺，紫外線表面滅菌 1 h，準備接種。

1.2.2 獲得無菌材料

取新鮮的葉片，先用流水沖洗 30 min，然后放到超凈工作臺上，用75%乙醇滅菌30 s，無菌水沖洗4次，再用0.1% HgCl2滅菌8 min，無菌水沖洗4次[13-14]，用無菌濾紙吸干材料表面的水分。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

用打孔器將材料切成大小均勻的若干小圓片，將材料接種在M1～M50培養(yǎng)基上，先經(jīng)暗培養(yǎng)24 h，然后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)接種30 d后的觀察結(jié)果

以葉片為外植體，葉片切口處有膨大現(xiàn)象最早是第6天，10 d后大多數(shù)成活葉片切口處均有膨大的現(xiàn)象，14 d后有白色顆粒狀的愈傷組織出現(xiàn)。這與趙慧賢等的組培報道中以葉片為外植體的形成時間[15]略有差異，這可能與金銀花的品種不一樣有關(guān)。

從愈傷組織組數(shù)觀察結(jié)果（表2）中可以計算出，在愈傷組織在形成過程中，150瓶培養(yǎng)瓶中污染率為6.00%，死亡率為18.67%，誘導(dǎo)率為76.99%（誘導(dǎo)率為誘導(dǎo)數(shù)除以除去污染數(shù)和死亡數(shù)的接種總數(shù)）。

2.2 不同濃度的生長素對愈傷組織誘導(dǎo)的效果

試驗結(jié)果（表3、表4）表明，IAA和NAA都是在0.5～1.0 mg/L 的濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)效果較好。其中又以NAA 濃度為1.0 mg/L 時效果最好，誘導(dǎo)率最高，達91.67%。隨著 1.0 mg/L 濃度升高誘導(dǎo)率下降；當(dāng)濃度低于0.5 mg/L 時，誘導(dǎo)效果也欠佳。IAA濃度為1.0 mg/L時誘導(dǎo)率也較高，達到88.89%。這與劉連芬等的組培報道中金銀花愈傷組織形成的最佳生長素濃度結(jié)果[16]基本一致。

2.3 不同濃度的細胞分裂素對愈傷組織誘導(dǎo)的效果

試驗結(jié)果（表5、表6）表明，生長素為IAA或者NAA的情況下，6-BA都是在1.5 mg/L的濃度誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率高達100%。

2.4 不同生長素/細胞分裂素組合對愈傷組織誘導(dǎo)的效果

接種14 d后，葉片外植體開始變綠且變厚，接觸到培養(yǎng)基的外植體表面長出米粒狀的白色愈傷組織。30 d后，葉片愈傷組織以深褐色和淡黃色為主，深褐色的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，質(zhì)地較硬，呈不透明狀；淡黃色的愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，質(zhì)地松軟，呈透明狀。對比發(fā)現(xiàn)M3、M8、M15、M16、M17、M19、M22、M24、M29、M31、M34、M39、M42、M44、M47、M49效果較好（表7），生長速度快且愈傷組織多，其中又以M44（MS+15 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA）效果最好。因此較理想的金銀花愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。

3 討論

本試驗中葉片的污染率（6.00%）較高，可能是因為葉片與空氣接觸的時間較長，被空氣中的微生物侵染的幾率較大，也可能是因為在滅菌過程中，滅菌劑濃度較低或者滅菌時間較短；死亡率（18.67%）較高，這可能是因為葉片脫毒時操作時間過長對葉片組織破壞，也可能是因為接種時鑷子在酒精燈上烤燒的時間過長，冷卻較慢，容易燙傷葉片。試驗觀察到的2種不同狀態(tài)的愈傷組織，哪一種更適合做傳代培養(yǎng)[17]，這還需要進一步研究。此外，因試驗條件和試驗時間的限制，本試驗接種組數(shù)較少，故其數(shù)據(jù)不具有普遍推廣意義。

參考文獻：

[1]王光全，孟慶杰，張志忠. 金銀花生物學(xué)特性及其栽培利用[J]. 江蘇林業(yè)科技，2000，27（6）：36-37.

[2]王恒波，袁月芳. 金銀花繁育栽培技術(shù)[J]. 河北林業(yè)科技，2003（3）：38-39.

[3]馬清溫，丁作超，孫震曉，等. 山東藥用植物[M]. 濟南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，1998.

[4]陳志遠，祁承經(jīng)，湯庚國，等. 樹木學(xué)：南方本[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2005.

[5]趙國玲，劉佳佳. 金銀花化學(xué)成分及藥理研究進展[J]. 中藥材，2002，25（10）：762-763.

[6]王林青，崔保安，張紅英. 金銀花藥理作用研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（11）：91-95.

[7]楊小紅. 金銀花的培養(yǎng)[J]. 植物雜志，1989（5）：8.

[8]王天志，李永梅. 金銀花的研究進展[J]. 華西藥學(xué)雜志，2000（4）：292-294，298.

[9]于生蘭，張 龍，孫 玲.金銀花的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2002，13（8）：498-500.

[10]王光全，孟慶杰，孟慶軍. 鳳爪金銀花的組織培養(yǎng)技術(shù)[J]. 河北林業(yè)科技，2002（5）：25.

[11]仇 鍵，譚曉風(fēng).蒙花1、2號金銀花的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報，2005，25（4）：53-56.

[12]楊 峰，劉巧蓮，代真真，等. 不同基本培養(yǎng)基和外植體對劍麻愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報，2012，33（3）：475-478.

[13]李景剛，孫滿芝. 良種金銀花的組培快繁技術(shù)研究[J]. 山東林業(yè)科技，2004（6）：36-37.

[14]戴小英，洪林育，龔 斌，等. 金銀花優(yōu)良無性系離體快繁研究[J]. 江西林業(yè)科技，2010（6）：10-11，15.

[15]趙賢慧，劉慶華，王奎玲，等. 誘導(dǎo)紅金銀花愈傷組織的影響因素研究[J]. 山東林業(yè)科技，2007（1）：9-11.

[16]劉連芬，錢關(guān)澤. 金銀花（Lonicera japonica Thunb.）愈傷組織的誘導(dǎo)和分化[J]. 聊城大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2007，20（4）：48-50，107.

[17]曹方莉，王曉明，趙思東，等. 花蕾型金銀花同源四倍體的誘導(dǎo)和鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：3619-3621.