互葉白千層的快繁技術(shù)

殷勤　杜尚廣　張青等

摘要：為研究出一套完整的互葉白千層快繁技術(shù)體系，以互葉白千層幼苗莖段為外植體，分別以誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)、生根率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、叢生芽增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ 0.01%活性炭+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，誘導(dǎo)率為82.8%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+0.25 mg/L 6-BA，增殖倍數(shù)為31倍；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+30 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA，生根率達(dá)100%，移栽30 d后成活率達(dá)80%以上。研究結(jié)果為互葉白千層的工廠化育苗提供了技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：互葉白千層；快速繁殖；正交試驗(yàn)；芽誘導(dǎo)；叢生芽增殖；生根

中圖分類號(hào)： Q945.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0020-04

互葉白千層（Melaleuca alternifolia）為桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬 （Melateuca）常綠小喬木，原產(chǎn)于澳大利亞的新南威爾士州和新西蘭的部分地區(qū)[1]，是近年我國(guó)成功引進(jìn)的高價(jià)值經(jīng)濟(jì)植物及綠化樹(shù)種。互葉白千層對(duì)污染物有很強(qiáng)的凈化能力[2-4]，可用于構(gòu)建植物浮床[5]?；ト~白千層的新鮮枝葉和樹(shù)干提取的精油俗稱茶樹(shù)油，可以高效、無(wú)毒、無(wú)刺激地殺死人體皮膚表面的真菌和細(xì)菌[6-9]，并對(duì)某些病毒也有抑制作用[10-11]，是一種強(qiáng)效的抗菌劑[12-17]、殺蟲(chóng)劑[18-20]、芳香劑[21]、防腐劑[22]，是不可多得的天然保健醫(yī)藥材料，廣泛應(yīng)用于制藥、日化、食品、香料等行業(yè)。因此，種植互葉白千層具有巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)互葉白千層的研究主要集中在其精油的提取、成分分析及作用等方面[23-24]，而對(duì)利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行再生植株的研究較少，目前尚沒(méi)有完整的快繁技術(shù)體系。依據(jù)精油化學(xué)成分含量的不同，互葉白千層分為6種[25]，其中僅松油醇-4型優(yōu)良品種提取的精油成分滿足國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[26]。為獲得品種優(yōu)良的互葉白千層，使用種子繁殖多敗育，發(fā)芽率很低[27]，且后代易產(chǎn)生變異，難以保持親本優(yōu)良性狀；扦插繁殖生根率雖高[28]，但成活率較低[29]。組織培養(yǎng)既可以保持親本的優(yōu)良性狀，又可以將獲得的優(yōu)良株系快速推廣應(yīng)用于生產(chǎn)，有望成為互葉白千層產(chǎn)業(yè)化育苗的主要繁殖手段。

本試驗(yàn)以互葉白千層莖段為材料，進(jìn)行表面滅菌處理，對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并對(duì)試管苗馴化移栽，擬建立一套完整的互葉白千層快繁技術(shù)體系，為互葉白千層的優(yōu)株選育提供理論依據(jù)，為其工廠化育苗提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

互葉白千層為溫室栽培植株，株高20 cm，由江西撫州市森源生物科技有限公司提供。

1.2 儀器

W-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)），LMQJ型立式滅菌鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)），JY2002電子分析天平（精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），JA1003N電子天平（精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）。

1.3 方法

1.3.1 外植體的表面滅菌及預(yù)處理 培養(yǎng)60 d的溫室種植的互葉白千層幼苗，株高30 cm，在20 cm處去頂。30 d后，隨機(jī)剪取5 cm的幼苗莖段，剪去部分葉片，用洗衣粉液浸泡30 min，流水沖洗2 h；70%乙醇處理30 s，無(wú)菌水洗3次，然后用 0.1% HgCl2處理3 min，無(wú)菌水洗4次，待用；去掉莖段頂部，剪取約1 cm、含4～5個(gè)節(jié)點(diǎn)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。為了降低酚類物質(zhì)氧化褐變引起的生長(zhǎng)抑制，在第3 天將莖段轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中。

1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用3因素4水平L16（43）正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表1。共16組固體培養(yǎng)基，每組8瓶，每瓶5個(gè)莖段；30 d后統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)芽的外植體數(shù)、芽數(shù)，并計(jì)算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率的計(jì)算公式如下：

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)×100%。

1.3.3 增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用3因素4水平L16（43）正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表2。共16組液體培養(yǎng)基，每組16瓶，每瓶5個(gè)誘導(dǎo)出單芽的莖段；60 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽數(shù)，并計(jì)算增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù)的計(jì)算公式如下：

增殖倍數(shù)=叢生芽數(shù)÷接種的外植體數(shù)×100%。

1.3.4 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表3。共9組固體培養(yǎng)基，每組10瓶，每瓶5個(gè)幼枝莖段；30 d后統(tǒng)計(jì)生根的外植體數(shù)，并計(jì)算生根率。生根率的計(jì)算公式如下：

生根率=生根的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)×100%。

1.3.5 移栽 生根培養(yǎng)30 d后，將試管苗轉(zhuǎn)移到室外煉苗，散射光光照培養(yǎng)10～20 d，當(dāng)組培苗抽高生長(zhǎng)，木質(zhì)化程度加強(qiáng)時(shí)，即可移栽。取出試管苗，清洗根部，再用0.1%高錳酸鉀溶液消毒30 s，自來(lái)水清洗除去殘留的高錳酸鉀，然后把試管苗移栽至含基質(zhì)（泥炭 ∶[KG-*3]珍珠巖=1 ∶[KG-*3]1）的花盆里，遮陽(yáng)網(wǎng)遮陽(yáng)，將1 L的塑料飲料容器底部剪掉，罩在試管苗上，保持幼苗周?chē)鷿駶?rùn)。14 d后，遮陽(yáng)網(wǎng)部分移除，容器一側(cè)抬起以露出植物。再過(guò)7 d后，遮陽(yáng)網(wǎng)移除，移走容器。移栽30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.4 培養(yǎng)條件

溫度（25±2） ℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度2 500～3 000 lx。誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，通過(guò)添加各種不同濃度的激素或蔗糖、MS成分減半進(jìn)行優(yōu)化；固體培養(yǎng)基中加7.0 g/L瓊脂，調(diào)pH值為5.8；液體培養(yǎng)基不加瓊脂，不調(diào)節(jié)pH值，實(shí)際測(cè)得pH值為5.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化

互葉白千層莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。極差分析表明，3個(gè)因素對(duì)互葉白千層芽誘導(dǎo)的影響大小依次為：NAA>活性炭6-BA。隨著NAA濃度的增加，誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)；當(dāng)活性炭濃度為0.01%、6-BA濃度為 0.1 mg/L、NAA 濃度為0.05 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)出芽數(shù)是2.46個(gè)，誘導(dǎo)率是82.8%。方差分析表明，3個(gè)因素對(duì)誘導(dǎo)率及芽數(shù)無(wú)顯著影響（表5、表6）。

芽誘導(dǎo)主要是已有芽原基在解除頂端優(yōu)勢(shì)之后的萌發(fā)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基對(duì)外植體的誘導(dǎo)率及芽數(shù)無(wú)顯著影響，最佳誘導(dǎo)效果的培養(yǎng)基為：MS+0.01%活性炭+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。

2.2 增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

互葉白千層芽誘導(dǎo)后在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)60 d，增殖倍數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表7。極差分析表明，3個(gè)因素對(duì)互葉白千層芽增殖的影響大小依次為：NAA>6-BA>蔗糖。隨著NAA濃度的增加，增殖倍數(shù)呈下降趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度為0時(shí)增殖倍數(shù)最高。隨著6-BA濃度的增加，增殖倍數(shù)先增大后減小，當(dāng)6-BA濃度達(dá)0.250 mg/L時(shí)增殖倍數(shù)最高，這可能是由于低濃度的6-BA促進(jìn)細(xì)胞分裂，而高濃度的6-BA則抑制細(xì)胞分裂。隨著蔗糖濃度的增加，增殖倍數(shù)先增大后減小，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)30 g/L時(shí)，增殖倍數(shù)最高。方差分析表明（表8），NAA對(duì)增殖倍數(shù)影響達(dá)顯著水平（P<0.05）?；ト~白千層芽增殖的最佳培養(yǎng)基組合為：MS+30 g/L蔗糖+ 025 mg/L 6-BA，增殖倍數(shù)達(dá)31倍。

List等采用單因素試驗(yàn)獲得的增殖培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基+1.0 mg/L BA，培養(yǎng)時(shí)間為63 d，增殖倍數(shù)為5.5倍[30]。De Oliveira等同樣用單因素試驗(yàn)獲得的增殖培養(yǎng)基為MS液體培養(yǎng)基+0.25 mg/L BA，培養(yǎng)時(shí)間為56 d，增殖倍數(shù)為118倍[31]。樊吉尤等用不同激素組合進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明較好的激素組合是0.8 mg/L 6-BA+0.01 mg/L 2，4-D，增殖倍數(shù)為14.88倍[32]。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)，獲得了最佳的增殖培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)達(dá)31倍，而且叢生芽較粗壯，呈深綠色（圖1-C），結(jié)果顯著好于已往報(bào)道。主要原因有：（1）互葉白千層通常生長(zhǎng)在沼澤中[33]，喜酸性或微酸性土壤[34-35]，本試驗(yàn)使用的液體培養(yǎng)基，pH值為5.2，適合其生長(zhǎng)；（2）以往研究一般在培養(yǎng)基中僅添加NAA，本試驗(yàn)將其設(shè)定為因素之一，結(jié)果表明，NAA與增殖倍數(shù)呈負(fù)相關(guān)，不加NAA的第6處理的培養(yǎng)基效果最佳；（3）本試驗(yàn)使用的是液體培養(yǎng)基，養(yǎng)分交換非常充分，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以更好地被吸收[31]。

由表7可知，第8處理的培養(yǎng)基中外植體的增殖倍數(shù)為0，觀察發(fā)現(xiàn)該組培養(yǎng)基中的外植體無(wú)明顯生長(zhǎng)，逐漸變成褐色，可能原因是激素配比不利于芽的生長(zhǎng)，同時(shí)液體培養(yǎng)基中氧氣含量比較低，外植體易發(fā)生缺氧壞死。

2.3 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化

生根培養(yǎng)30 d后，生根率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表9。極差分析表明，對(duì)互葉白千層生根率的影響大小依次是：NAA>基本培養(yǎng)基=IAA>蔗糖。由表9可知，所有培養(yǎng)基的生根率都在80%以上，第6處理的生根率和根系發(fā)達(dá)程度最高。觀察可知，該處理試管苗根系發(fā)達(dá)，有3級(jí)根，一級(jí)根上生成粗細(xì)不同的二級(jí)根，并且在粗二級(jí)根上形成三級(jí)根，各級(jí)根上均有少量根毛；在以后煉苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，這樣的根系更加有利于移栽成活。因此，最佳生根培養(yǎng)基是含30 g/L蔗糖、0.1 mg/L NAA和 0 mg/L IAA的1/2MS培養(yǎng)基。

2.4 移栽

幼苗移栽是試管苗從實(shí)驗(yàn)室適宜生長(zhǎng)環(huán)境到復(fù)雜外界環(huán)境，并發(fā)生從異養(yǎng)到自養(yǎng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程。因此，移栽前要進(jìn)行煉苗，讓試管苗更好地適應(yīng)自然環(huán)境。在本試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)煉苗，幼苗的地上、地下部分均具有較強(qiáng)木質(zhì)化，移栽成活率達(dá)80%以上；其中，莖部粗壯、葉片濃綠、根系發(fā)達(dá)的幼苗，移栽時(shí)更易成活。

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)得出互葉白千層外植體的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.01%AC +0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)82.8%；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+0.25 mg/L 6-BA，增殖倍數(shù)達(dá)31倍；最佳生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+30 g/L 蔗糖+ 0.1 mg/L NAA，生根率達(dá)100%；移栽 30 d 后，成活率達(dá)80%以上。研究結(jié)果為互葉白千層的工廠化育苗提供了科學(xué)依據(jù)。

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