鄭玉紅　張智　陸波等

摘要：采用RAPD分子標(biāo)記，對(duì)彩色馬蹄蓮Parfait（Pr）及其秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體（Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的變異進(jìn)行研究。從40個(gè)寡聚核苷酸引物種篩選出14個(gè)合適的引物進(jìn)行擴(kuò)增，5個(gè)樣品共擴(kuò)增出位點(diǎn)90個(gè)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出6.29個(gè)位點(diǎn)；其中，多態(tài)性位點(diǎn)39個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)的比率為43.33%。此外，還觀察到的等位基因數(shù)（na）為1.4021個(gè)，有效等位基因數(shù)（ne）為1.2965個(gè)，Neis基因多樣性（h）為0.166 6，Shannons多樣性指數(shù)（I）為0.242 1?？梢?jiàn)，多倍體誘導(dǎo)和輻射誘變使彩色馬蹄蓮Parfait在分子水平產(chǎn)生了一定的變異，豐富了彩色馬蹄蓮遺傳多樣性。通過(guò)聚類分析將5個(gè)樣品可分為2支，其中Pr、Pr-2和Pr-d聚為一支，Pr-1和Pr-4聚為一支。

關(guān)鍵詞：多倍體；誘導(dǎo)；彩色馬蹄蓮；RAPD；遺傳相似性；聚類分析；抗病育種；分子生物學(xué)

中圖分類號(hào)： S335.21；S682.2+64.03 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0142-02

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia hybrida）為天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本植物，原產(chǎn)于南非[1]。自20世紀(jì)80年代末引入我國(guó)以來(lái)，彩色馬蹄蓮以其花色絢爛、花形高雅、觀花期長(zhǎng)而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，因此被稱為21世紀(jì)的“明星花卉”。彩色馬蹄蓮在栽培過(guò)程中最嚴(yán)重的病害是軟腐病[2]，其在引種到我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)后受高溫高濕的影響，軟腐病病害問(wèn)題更加突出，培育抗軟腐病的彩色馬蹄蓮品種是解決這一問(wèn)題的有效途徑。但彩色馬蹄蓮所有品種對(duì)該病的抗性均比較弱；而且目前彩色馬蹄蓮新品種培育方式以雜交育種為主。很顯然，這種育種方式很難培育出抗病的彩色馬蹄蓮品種。所以，研究人員探索采用物理或化學(xué)誘變的方式提高彩色馬蹄蓮的抗病性，從而培育抗病的彩色馬蹄蓮品種。本試驗(yàn)采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)彩色馬蹄蓮品種Parfait（編號(hào)為Pr）及其秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體（編號(hào)為Pr-d）和20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（分別編號(hào)為Pr-1、Pr-2和Pr-4）分子水平的變異和差異進(jìn)行研究，為彩色馬蹄蓮抗病新品種的培育提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為2002年引種自荷蘭的彩色馬蹄蓮品種Parfait，其佛焰苞粉紅色（上紅下白），葉片盾劍形，上有斑點(diǎn)，引種后在本地的適應(yīng)性良好。除Parfait外，還有經(jīng)20、40、60 Gy 60Co γ射線輻射處理的Parfait組培苗及秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體Parfait組培苗共5個(gè)樣品，每個(gè)樣品組培苗繼代次數(shù)均在10次以上，隨機(jī)選取10株，每株分別取樣，然后混合，用于提取DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 模板DNA的制備與檢測(cè)

采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司出品的新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取彩色馬蹄蓮葉片DNA；采用貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)的DU800紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度和含量，并對(duì)濃度較高的樣品進(jìn)行稀釋，-20 ℃儲(chǔ)存，備用。

1.2.2 RAPD-PCR 體系及引物篩選

以提取的彩色馬蹄蓮Parfait DNA為模板，參照陸波等的方法[3]，對(duì)北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成的40條引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，選擇條帶多態(tài)性強(qiáng)、擴(kuò)增位點(diǎn)多的引物對(duì)供試的彩色馬蹄蓮品種及Parfait輻射誘變處理和多倍體進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶按有（記為1）、無(wú)（記為0）進(jìn)行記錄，在Excel表格上生成數(shù)據(jù)矩陣。計(jì)算擴(kuò)增條帶的多態(tài)率，用POPGen32軟件[4]進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 彩色馬蹄蓮樣品RAPD分子標(biāo)記結(jié)果

利用篩選出來(lái)的引物，對(duì)彩色馬蹄蓮 Parfait、Parfait四倍體和輻射誘變后代進(jìn)行RAPD-PCR，最終篩選出具有特異性條帶的引物14個(gè)，共獲得90個(gè)位點(diǎn)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出6.43個(gè)位點(diǎn)；其中，多態(tài)性位點(diǎn)39個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比例為4333%。引物RAPD-47和RAPD-66擴(kuò)增出的位點(diǎn)最多，均為9個(gè)；RAPD-73擴(kuò)增出的位點(diǎn)最少，僅4個(gè)。引物RAPD-66擴(kuò)增出的多態(tài)位點(diǎn)比例最高，為88.89%；有半數(shù)引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)全部為共有位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比例為0（表1）。由引物66擴(kuò)增的RAPD圖譜（圖1）可見(jiàn)，多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射使Parfait擴(kuò)增片段減少，從而表現(xiàn)出多態(tài)性。

2.2 彩色馬蹄蓮Parfait 四倍體及其輻射誘變后代分子水平變異分析

5個(gè)陳彩色馬蹄蓮樣品觀察到的等位基因數(shù)（na）為1402 1個(gè)，有效等位基因數(shù)（ne）為1.296 5個(gè)，Neis基因多樣性（h）為0.1666，Shannons多樣性指數(shù)（I）為0.242 1。

2.3 彩色馬蹄蓮Parfait多倍體及其輻射誘變與其他品種的親緣關(guān)系的聚類分析

由表2可知，40 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-2）與四倍體Parfait（Pr-D）遺傳相似系數(shù)最大，為0.886 6；Parfait與其60 Gy 60Co γ射線輻射誘變后代（Pr-4）間遺傳相似系數(shù)最小，為0.701 0；所有樣品遺傳相似系數(shù)的平均值0.791 8。

由圖2可以看出，5個(gè)樣品可分為2類，Pr、Pr-2和 Pr-D 聚為一支；Pr-2和Pr-4聚為一支。

3 結(jié)論與討論

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，我國(guó)共引入彩色馬蹄蓮品種40多個(gè)。此后，我國(guó)研究人員對(duì)彩色馬蹄蓮的快繁技術(shù)[5-6]、栽培措施[7-9]、花期調(diào)控[10-12]和抗病生理[13-14]等進(jìn)行了廣泛的研究，但關(guān)于彩色馬蹄蓮的分子生物學(xué)方面的研究?jī)H有零星的報(bào)道[15-17]。在彩色馬蹄蓮品種間的親緣關(guān)系和多樣性分析方面，迄今只有張永春等利用ISSR對(duì)10個(gè)彩色馬蹄蓮品種進(jìn)行鑒定[17]。本試驗(yàn)利用RAPD技術(shù)研究多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射對(duì)彩色馬蹄蓮品種Parfait分子水平遺傳變異的影響，結(jié)果表明，Parfait、Parfait四倍體及其 60Co γ射線輻射處理多態(tài)性條帶比率最高為88.89%，平均值為 43.33%，多態(tài)性主要表現(xiàn)為多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射使Parfait的擴(kuò)增片段減少，但這種多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于彩色馬蹄蓮品種間多態(tài)性[17]；但與陳臻等基于ISSR標(biāo)記 12C6+重離子輻射下的彩色馬蹄蓮多態(tài)性十分接近[18]。各樣品間的遺傳相似系數(shù)最大為0.886 6，低于彩色馬蹄蓮品種間的遺傳相似系數(shù)[17]，說(shuō)明多倍體誘導(dǎo)和 60Co γ射線輻射處理致使Parfait分子水平的變異已經(jīng)達(dá)到了品種水平。在對(duì)其變異性狀及其穩(wěn)定性進(jìn)行觀測(cè)的基礎(chǔ)上，培育出彩色馬蹄蓮新品種是完全可能的。同時(shí)，各樣品多態(tài)性條帶比率最高達(dá)88.89%，表明通過(guò)建立彩色馬蹄蓮品種分子指紋圖譜鑒別彩色馬蹄蓮品種以解決市場(chǎng)上彩色馬蹄蓮品種混亂的問(wèn)題是可行的。

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