陶菲+童益琴++趙杰+南皓+楊立春+李江浩+葛臺明

摘要：采用FIASCO法構建了芝麻（Sesamum indicum L.）GATA＼AAAG＼AAAC微衛(wèi)星富集文庫，陽性克隆率62%，其中58%為完美型SSR。利用30個芝麻材料對其中10個擴增穩(wěn)定、多態(tài)性好的SSR位點進行了多樣性分析，等位基因數(shù)介于4～7之間，平均6.2個；有效等位基因數(shù)介于2.18～5.13之間，平均3.73。25個育成品種（系）遺傳相似系數(shù)平均為0.740 7，遺傳距離平均為0.258 9；5個地方品種間的遺傳相似系數(shù)平均為0.659 3，遺傳距離平均值為0.312 8，說明地方品種多樣性比育成品種（系）豐富。AMOVA分析表明，品種（系）間變異大于品種（系）內變異，地方品種種內變異大于育成品種（系）。聚類分析表明，一把白與所有育成品種（系）聚為同一類。研究還鑒定出一些遺傳差異較大的材料。

關鍵詞：芝麻（Sesamum indicum L.）；SSR標記；FIASCO；遺傳多樣性

中圖分類號：S565.3∶Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2586-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.008

Development of SSR Markers and Analysis on Genetic Diversity in

Sesamum indicum L. Based on FIASCO

TAO Feia，TONG Yi-qinga，ZHAO Jiea，NAN Haoa，YANG Li-chuna，LI Jiang-haoa，GE Tai-minga，b

（a.Hubei Key Laboratory of Wetland Evolution and Ecological Restoration；

b. School of Environmental Studies， China University of Geosciences（Wuhan）， Wuhan 430074， China）

Abstract： In this study， 100 clones were randomly selected from the library enriched for GATA＼AAAG＼AAAC motifs using a modified FIASCO （Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats） protocol and sequenced in sesame （Sesamum indicum L.）. Sixty-two microsatellite loci， of which 58% were pure repeats， were isolated. 10 highly polymorphic microsatellite markers were obtained， and their polymorphism were assessed among 30 cultivars with 30 individuals per cultivar. The average number of alleles for these loci was 6.2 （range 4-7）. The effective number of alleles ranged from 2.18 to 5.13 with an average of 3.73. The expected heterozygosity was higher than the observed heterozygosity indicating the inbreeding effect due to breeding. These markers were also used to assess the genetic variation of 30 sesame cultivars. The results showed that the average genetic similarity coefficient and the average genetic distance of 25 breeding varieties were 0.7407 and 0.2589 respectively， and the average genetic similarity coefficient and the average genetic distance of 5 landraces were 0.6593 and 0.3128 respectively demonstrating that the genetic diversity of landraces was higher than that of breeding varieties. AMOVA analysis indicated that most genetic variation existed among varieties （strains） （P<0.001）. The results also implied that the genetic base of breeding varieties was narrower that that of landraces. Clustering analysis indicated that all 30 sesame varieties （strains） were classified into 2 groups. What's more， landrace Yibabai and all breeding varieties （strains） were clustered into 1 group showing that all the tested breeding varieties （strains） had very close genetic relationship. Some varieties with wide genetic variation were identified.endprint

Key words： sesame （Sesamum indicum L.）； SSR marker； FIASCO； genetic diversity

芝麻（Sesamum indicum L.）為胡麻科（Pedaliaceae）胡麻屬（Sesamum）一年生草本植物，是世界上最古老的油料作物之一。芝麻種植區(qū)主要分布在溫帶和熱帶，其中印度、緬甸、蘇丹和中國是較大的生產(chǎn)國。芝麻營養(yǎng)價值很高，富含蛋白質、氨基酸及豐富的礦物質、粗纖維及多種維生素[1]。早期芝麻遺傳學研究多注重在形態(tài)學[2-4]及細胞學[5-8]特征上，這些標記因重復性差、標記數(shù)量少而未被廣泛應用。DNA分子標記因不受環(huán)境影響，穩(wěn)定性好及多態(tài)性高而在眾多作物中有著廣泛的應用。在芝麻分子水平研究中，采用了RAPD[9-11]、ISSR[12，13]、SRAP[14-16]、AFLP[17-19]、EST[20-22]等眾多分子標記。

SSR（Simple sequence repeat）標記又稱微衛(wèi)星（Microsatellite）標記，具有豐富的多態(tài)性，符合孟德爾式共顯性遺傳的特性，且操作簡便，已被成功應用于芝麻SSR遺傳分析[23-25]。Laurentin等[26]通過分子方差分析發(fā)現(xiàn)供試種種間僅存在5%的變異。但總體來說，芝麻SSR標記仍然偏少，且多為重復單元較短的2堿基重復的SSR標記。這類短重復單元SSR標記在分析過程中極易產(chǎn)生嚴重的影子帶，從而影響結果的準確性。因而，芝麻遺傳多樣性研究還需要開發(fā)更多的優(yōu)質SSR標記，例如高多態(tài)性、擴增穩(wěn)定、且具較長重復單元的優(yōu)質SSR標記。

另外，由前人研究結果可知，芝麻育成品種的遺傳基礎較為狹窄[27]。為了指導遺傳改良中的親本選配，以及種質資源的研究，有必要了解地方品種和育成品種的遺傳多樣性及其差異。本研究應用FIASCO法[28]構建芝麻微衛(wèi)星文庫，通過所開發(fā)的微衛(wèi)星標記研究了芝麻供試材料中育成品種（系）與地方品種的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，比較分析了育成品種（系）與地方品種種間及品種內的遺傳差異，為今后芝麻育種親本合理組配及雜種優(yōu)勢利用等提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芝麻30個品種（系）的種子由中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所（中油所）提供。供試材料包含育成品種（系）和地方品種兩大類型，來源地分別為河南、山東、湖北、中油所及前蘇聯(lián)。其中25個供試材料為中油所保存、培育的芝麻育成品種（系）。地方品種中除塔世干122由前蘇聯(lián)引進，其余均源自中國。具體見表1。

1.2 方法

1.2.1 FIASCO法構建芝麻微衛(wèi)星文庫

1）芝麻基因組提取及純化。將供試材料22M3724芝麻種子在25 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽，取幼芽組織0.5 g，用常規(guī)CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取出絲狀DNA沉淀后，轉入純化步驟。純化方法如下：用1 mL含終濃度20 μg/ml RNase A的TE緩沖液（pH8.0）重新溶解沉淀，37 ℃保溫30 min消化RNA，常規(guī)酚抽提后，異丙醇重新沉淀DNA，脫鹽處理后重新溶解于TE（1 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH=8.0）。提取的基因組DNA用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000檢測其質量，計算濃度配成250 ng/μL DNA備用。

2）SSR標記的分離及引物設計?；蚪MDNA經(jīng)內切酶CviQI（Biolabs）酶切3 h。酶切體系（50 μL）包括：4 U CviQI內切酶，250 ng DNA，1×NE Buffer 3 μL，100 μg/mL BSA。將酶切產(chǎn)物與雙鏈接頭[接頭A序列為：5′-gATgAgTCCTgACTAC（N）-3′， 接頭B序列為：5′-gACgATgAgTCCTgAg-3′] （N代表堿基A， G， C， T）于16 ℃連接過夜，10 μL連接反應體系如下：1 μmol/L接頭，25 ng DNA，5 μL Sollution I，2.5 μL Sollution Ⅱ。

連接產(chǎn)物用TE緩沖液按1∶9稀釋后，以G+CviQI引物（5′-gATgAgTCCTgACTAC-3′）進行PCR擴增。PCR反應體系（10 μL）包括：1×PCR 反應緩沖液，2.5 μmol/L G+CviQI引物，200 μmol/L dNTPs， 1∶9稀釋的連接產(chǎn)物 2.5 μL，0.25 U Taq DNA聚合酶，2 mmol/L MgCl2。反應程序如下：94 ℃預變性5 min，循環(huán)（94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s） x次，72 ℃延伸10 min，x為22，24及26，以PCR產(chǎn)物在250～750 bp之間且形成明顯的smear為最佳循環(huán)次數(shù)。

將40 μL PCR產(chǎn)物與3′帶生物素標記的寡核苷酸探針（GATA）6、（AAAC）6和（AAAG）6（分別1 μmol/L）進行雜交，雜交條件如下：95 ℃變性2 min，在各探針退火溫度（Ta=Tm-2，各探針Tm值由NEB公司網(wǎng)站計算得出）下雜交30 min，緩慢冷卻至室溫。再加入12.5 μL 的5 mol/L NaCl使得Na+終濃度為1 mol/L。M280鏈酶親和素磁珠（Promega）用TEN1000洗滌3次后用49 μL TEN100平衡，之后加入1 μg經(jīng)超聲波打碎的E. coli DNA封閉磁珠表面非特異結合位點。將雜交產(chǎn)物與處理的磁珠混勻，按照Zane等[28]描述的方法，進行非嚴謹洗脫和嚴謹洗脫，最后95 ℃水浴10 min，水浴后將離心管置于磁力架上，吸出富含目標SSR單鏈DNA的片段。

以上述洗脫液為模板，用引物G+CviQI進行第二次PCR擴增，檢測富集效果。PCR反應體系及程序如上。PCR擴增后效果好的樣品經(jīng)BioTeke PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化產(chǎn)物按說明書與PMD18-T載體（Takara公司）連接，轉化到本實驗室自制的Top10感受態(tài)細胞中。挑取陽性單菌落送往武漢擎科生物技術有限公司測序。將反饋回來的測序結果用SSRHunter 1.3軟件挑選出含有SSR標記的DNA片段。endprint

選取合適的SSR重復序列作為引物設計的原始序列。應用Primer Premier5.0軟件（http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/）初步設計引物，通過Oligo6.0軟件完成引物評價。選取得分較高的引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 芝麻SSR分型 在進行PCR擴增之前，對每對引物設計一個溫度梯度試驗。該溫度梯度包含Primer Premier5.0、Oligo6.0軟件及上海生工生物工程有限公司提供的最佳退火溫度，以找出最佳PCR擴增條件。

將供試芝麻品種的每個品種隨機播種30個個體，每個個體單獨用Chelex-100法[29]快速提取出DNA，用作引物擴增的模板DNA。

在各引物優(yōu)化最佳退火溫度（Ta）下進行PCR（10 μL）：1×Taq 反應緩沖液（含Mg2+），0.2 μmol/L 正向引物，0.2 μmol/L反向引物，200 μmol/L dNTP，10 ng 個體DNA，0.25 U Taq DNA聚合酶。反應條件如下：94 ℃預變性5 min，循環(huán)（94 ℃ 、30 s，Ta、30 s，72 ℃、30 s）30次，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 將銀染分型的基因型數(shù)據(jù)，使用POPGENE Version 1.31計算各基因座在群體中的等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），雜合度（Ho），期望雜合度（He）等參數(shù)。通過PIC_CAL軟件計算出每個SSR位點的PIC值（polymorphic information content）。按照帶型和樣本數(shù)及名稱建立一個“0，1”矩陣的Excel文檔，轉入到NTSYSpc Version 2.10e軟件中進行UPGMA聚類分析和計算遺傳距離及遺傳相似系數(shù)?；诿恳晃稽c等位基因的差異，采用ARLEQUIN Ver 3.0軟件中的AMOVA （Analysis of Molecular Variance）程序計算品種（系）間及品種（系）內的遺傳變異。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取

供試芝麻品種22M3724的OD260 nm /OD280 nm為1.97，從圖1A可以看出，芝麻基因組DNA大小在5 kbp以上，點樣孔干凈，無拖尾、雜帶，主帶清晰，點樣孔內無殘留。表明提取的芝麻基因組DNA純度高，質量好，能滿足后續(xù)試驗要求。

2.2 微衛(wèi)星文庫的構建

酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增后，主要片段集中在250～750 bp之間（圖1B），Smear條帶明顯，符合構建微衛(wèi)星文庫的要求。第二次PCR的擴增結果見圖1C，其中22個循環(huán)次數(shù)下富集到的DNA片段偏大，且Smear亮度不及24和26個循環(huán)次數(shù)，在后續(xù)的測序中有可能超出測序圖譜的置信區(qū)間。24和26循環(huán)次數(shù)下的富集片段大小合適（250～750 bp），Smear條帶明顯。因此用24和26循環(huán)次數(shù)的PCR富集產(chǎn)物構建文庫，共獲得約300個克隆，隨機挑選100個克隆進行測序，其中62個含有微衛(wèi)星序列（62%）。

依據(jù)Weber[30]提出的微衛(wèi)星序列分類標準，62個微衛(wèi)星位點中，完全型微衛(wèi)星36個，占58%；非完全型和復合型各13個，均占21%。另根據(jù)重復單元進行分類，重復次數(shù)大于或等于10的二堿基微衛(wèi)星28個，占45.2%；重復次數(shù)大于或等于8的三堿基微衛(wèi)星8個，占12.9%；重復次數(shù)大于或等于5的四堿基微衛(wèi)星24個，占38.7%；重復次數(shù)大于或等于3的六堿基微衛(wèi)星僅2個，占12.9%（表2）。三堿基及以上重復單元的SSR序列占到了全部SSR序列的大約55%，表明所建立的SSR富集文庫質量優(yōu)良。這些序列為后續(xù)多樣性分析提供了方便。

2.3 引物設計結果與優(yōu)化

用引物設計軟件Primer Premier5.0共設計引物50對，轉入Oligo6.0軟件評價得出得分最高的22對引物（GB Acc. No. KM521246-KM521267），引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。優(yōu)化PCR反應條件，以引物SIL-4為例（圖1D），期望產(chǎn)物片段大小157 bp，復性溫度43～45 ℃下擴增條帶均位于250 bp以上，46 ℃下開始出現(xiàn)目標片段但雜帶較多，48 ℃復性溫度下無雜帶，目標片段明顯，則最佳復性溫度為48 ℃。篩選出10對能夠穩(wěn)定且特異性擴增的引物，引物序列見表3。圖1E為引物SIL-6的擴增結果。

2.4 多態(tài)標記篩選

10對微衛(wèi)星引物在所有芝麻品種中均得到了較好的擴增，圖2為SIL-3引物在16個芝麻品種（系）間及D015品種內的擴增結果。

10個多態(tài)位點的等位基因數(shù)介于4～7之間，平均為6.2個，有效等位基因數(shù)為2.183 5-5.125 2，平均為3.725 6；觀測雜合度的變化范圍為0.002 2-0.660 0，平均為0.227 5；期望雜合度為0.610 0-0.805 3，平均為0.714 7；多態(tài)性信息含量PIC為0.488～0.776，平均為0.675（表4）。

2.5 不同品種（系）間的遺傳多樣性及遺傳分化

供試材料中25個為育成品種（系），5個為地方品種。分別對育成品種（系）和地方品種進行分析。表5顯示，25個育成品種（系）的SSR標記的遺傳相似系數(shù)平均為0.740 7，遺傳距離平均為0.258 9，親緣關系最近的是中油所的22M2202和22M2511，遺傳相似系數(shù)達到0.925 9，最遠的是22M2165和22M0968及22M2165和22M3375，相似系數(shù)均只有0.481 5；5個地方品種間的遺傳相似系數(shù)平均為0.659 3，遺傳距離平均值為0.312 8，親緣關系最近的是湖北的一把白與河南的二郎花芝麻，親緣關系最遠的是山東的大青秸和襄陽的鄂芝2號及蘇聯(lián)的塔世干122和湖北的一把白。地方品種間的平均遺傳相似系數(shù)小于育成品種（系），而平均遺傳距離大于育成品種（系），說明地方品種的遺傳多樣性比育成品種（系）的遺傳多樣性豐富，遺傳基礎較育成品種（系）寬。endprint

AMOVA分析表明，SSR遺傳變異絕大部分存在于種群間，貢獻的遺傳變異為73.11%（表6）。無論從總體看，還是以育成品種（系）與地方品種分別考察，品種（系）間的遺傳分化均極顯著高于品種（系）內的遺傳分化水平，P<0.01，表明芝麻SSR標記的遺傳多樣性主要存在于品種（系）間。

2.6 聚類分析

在相似系數(shù)0.61處30份材料被聚為兩類（圖3）：25份育成品種（系）和地方品種一把白為一類（A），表明所有25個育成品種（系）與一把白具有相近的親緣關系。4份地方品種為另一類（B）。

A類在相似系數(shù)0.722處被分成4個亞類：A1、A2，A3，A4。相似系數(shù)0.79處A1進一步被分為3個亞亞類：6份材料（22M0624、22M0625、22M0773、22M0663、22M0785、22M0801）、中芝13和3份材料（22M2118、22M2147、22M2149）；地方品種一把白位于A2亞類中；A3亞類存在親緣關系最近的兩份材料（22M2202和22M2511）；A4亞類中僅含22M3375和22M3395品種。

B類在相似系數(shù)0.65處可被分為2個亞類：河南的二郎花芝麻和山東的大青秸為一個亞類（B1），湖北的鄂芝2號和蘇聯(lián)的塔世干122為另一亞類（B2）。

3 討論

本研究隨機測序了100個克隆子，其中62個含有SSR序列，總陽性克隆率為62%?？梢?，F(xiàn)IASCO富集文庫法是一種高效的SSR分離方法。不同研究者[31，32]建立的FIASCO富集文庫的陽性克隆率有一定的差別，其主要原因可能是建庫過程中使用的條件不同，尤其是雜交溫度、洗脫嚴謹度（洗脫溫度和次數(shù)）等的差異。因此，探針雜交和富集是構建FIASCO富集文庫是否成功的兩個關鍵步驟。首先，能否選擇合適的雜交溫度很重要。與目的SSR序列雜交的每個探針的雜交條件都不同，而且同一探針的不同公式計算的Tm值都有差異。所以，必須正確選擇合適的雜交溫度。其次，能否選擇合適的洗脫強度是很重要。如果洗脫嚴謹度過高，則可能特異結合的DNA片段被洗掉而降低富集率。如果洗脫嚴謹度過低，則不能充分洗掉具有部分同源性的非特異DNA片段而降低富集率。Zane等[28]采用3次嚴謹?shù)南疵摵?次非嚴謹?shù)南疵摫ＷC目標片段的有效性。Nunome等[33]提出富集效率主要取決于雜交溫度與洗脫次數(shù)。其中探針同預擴增產(chǎn)物雜交的溫度對富集率影響不大，而富集過程中洗脫的次數(shù)對富集率影響較大。作者認為富集率的高低會受多方面的因素，而不是僅僅一個富集次數(shù)或溫度等單方面的因素的限制。雜交富集過程中的雜交溫度、洗脫溫度、洗脫次數(shù)以及洗脫液的鹽濃度等多因素都會影響富集效率。從測序結果看，我們富集到了較多的4堿基重復的SSR，而4堿基重復SSR具有多態(tài)性好、擴增帶紋清晰、影子帶干擾小等一系列優(yōu)點。說明富集工作比較成功。

經(jīng)由FIASCO法構建的微衛(wèi)星文庫所得到的10個微衛(wèi)星位點等位基因數(shù)平均為6.2個，有效等位基因數(shù)平均為3.7個，與Nweke等[25]得到的結果相似。觀測雜合度的變化范圍為0.002 2-0.660 0，平均為0.227 5；期望雜合度為0.610 0～0.805 3，平均為0.714 7。若期望雜合度與觀測雜合度數(shù)值接近則說明該物種受種內近交及外來選擇等因素的影響較小，可認為群體整體處于遺傳平衡狀態(tài)。對比可知期望雜合度數(shù)值均高于觀測雜合度數(shù)值，說明芝麻群體內因育成品種（系）比例大而受種內近交及外來選擇因素影響。多態(tài)性信息含量PIC代表一個標記依靠其可檢測的等位基因數(shù)和分布頻率，得出該標記在一個群體中的多態(tài)性數(shù)值。Spandana等[34]以60份芝麻種質資源為試驗材料，PIC均值高達0.77。本研究多態(tài)信息含量PIC為0.488～0.776，根據(jù)Botstein等[35]提出的標準，除SIL-8之外其余位點均屬于高度多態(tài)性（PIC>0.5），因此這些標記用于遺傳多樣性分析效果較好。

應用SSR標記進行作物品種間的遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離的報道較多，張濤等[36]利用微衛(wèi)星標記分析得出32個香稻品種的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.51～0.96。孫友位等[37]用SSR分析了85個玉米自交系，遺傳相似系數(shù)平均為0.66。楊先泉等[38]對四川馬鈴薯21份地方品種和10個育成品種進行了RAPD分析，得到地方品種間平均遺傳距離和變幅高于育成品種。本研究25個育成品種（系）的SSR標記的遺傳相似系數(shù)平均為0.740 7，遺傳距離平均為0.258 9；5個地方品種間的遺傳相似系數(shù)平均為0.659 3，遺傳距離平均值為0.312 8。結果表明地方品種的遺傳多樣性較育成品種（系）豐富。孫建等[39]用SRAP標記對67個中國芝麻主要品種的分析得出雜交選育品種間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離平均分別為0.910 7和0.067 2，地方品種的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離平均分別為0.895 0和0.071 4，與上述結果有著明顯差異。這可能與實驗材料不同、選用的分子標記和選用的各類型品種個體數(shù)量偏少有關。

遺傳變異是反映遺傳分化的重要指標。如前所述，本研究AMOVA分析結果表明，SSR遺傳變異絕大部分存在于品種（系）間。無論育成品種（系）還是地方品種，相比品種（系）內變異，品種（系）間的遺傳變異均達到極顯著水平（P<0.01），說明供試材料間遺傳分化明顯，不同類型品種間遺傳多樣性較豐富。但育成品種（系）內變異百分比少于地方品種內變異百分比的1/2，這在分子水平上說明育成品種（系）遺傳基礎較地方品種窄。

聚類分析將大多數(shù)地方品種與育成品種（系）聚在2個不同的類中，地方品種一把白與所有育成品種（系）聚為同一類，表明供試育成品種（系）具有較近的親緣關系，結果與AMOVA分析得出的“育成品種（系）遺傳基礎較地方品種窄”結論一致。育成品種（系）間除親緣關系最近的22M2202和22M2511之外，大多材料相似度不盡相同；另4個地方品種來自不同地區(qū)，品種間遺傳相似系數(shù)較低。分析認為，地方品種與育成品種（系）間親緣關系較遠，可能具有較高的雜交組配潛力。endprint

本研究成功地采用FIASCO法構建了芝麻微衛(wèi)星文庫，并成功得到10個擴增穩(wěn)定、多態(tài)性好的微衛(wèi)星位點。應用這10個微衛(wèi)星標記對供試材料分析結果顯示，地方品種比育成品種（系）的遺傳多樣性豐富。這些結果為芝麻品種的遺傳改良和種質資源研究等奠定了基礎。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所張秀榮和趙應忠研究員提供本研究所需芝麻品種（系）種子。

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