王琨 馬治敏 常超 王學(xué)東 伍金娥

摘要：研究了布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）對(duì)腸道菌群失調(diào)櫻桃谷肉鴨腸道酶的修復(fù)作用。將25只櫻桃谷肉鴨隨機(jī)分成正常對(duì)照組（5只）、抗生素組（20只）。建立櫻桃谷肉鴨菌群失調(diào)模型，菌群失調(diào)模型建立后，抗生素組分為4組，每組5只：即氨芐青霉素組，布拉迪酵母菌低劑量組（試驗(yàn)Ⅰ組）、中劑量組（試驗(yàn)Ⅱ組）、高劑量組（試驗(yàn)Ⅲ組），其中，氨芐青霉素組立即屠宰取樣并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，各劑量布拉迪酵母菌組按每天200 mL/只飼喂各劑量酵母菌菌懸液，正常對(duì)照組自由飲水，各組連續(xù)飲用15 d。觀察各組腸黏膜酶活性和基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明，布拉迪酵母菌具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)雙糖酶的活性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，對(duì)肉鴨黏膜蛋白質(zhì)含量無(wú)顯著影響。

關(guān)鍵詞：布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）；菌群失調(diào)；黏膜酶活；基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：S834 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）11-2690-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.035

Effect of Saccharomyces boulardii on Intestinal Enzyme Activity of

Meat Ducks with Intestinal Dysbacteriosis

WANG Kun，MA Zhi-min，CHANG Chao，WANG Xue-dong，WU Jin-e

（College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract：The experiment aimed at studying the repair effect on intestinal dysbacteriosis ducks by Saccharomyces boulardii. 25 Cherry valley ducks were randomly divided to 5 groups such as normal control group， four test groups which need construct intestinal dysbacteriosis model first for 10 days. After the dysbacteriosis model constructed the four groups were treated with ampicillin and different doses of Saccharomyces boulardii 200 mL per duck for 15 d. The ampicillin group were slaughtered after treatment and tested correlative index， and the Saccharomyces boulardii groups were observed about intestinal enzyme activity and gene expression. The results showed that Saccharomyces boulardii could moderate and enhance the activity of disaccharidase and absorption of nutrients， and had no significant effect on the intestinal mucosa protein of meat duck.

Key words： Saccharomyces boulardii；dysbacteriosis； mucosa enzyme activity；gene expression

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，長(zhǎng)期大量濫用抗生素導(dǎo)致畜禽腸道結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，并且影響動(dòng)物的免疫機(jī)能，應(yīng)用微生態(tài)制劑代替獸藥改善動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)一直是畜牧研究學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

正常情況下，腸道菌群具有特定的定性、定位和定量結(jié)構(gòu)，種群間處于一種有利于機(jī)體健康的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但當(dāng)這些正常的微生物菌群受到宿主生理狀況及飲食、藥物等的影響時(shí)，腸道正常菌群在種類(lèi)、數(shù)量和比例上發(fā)生異常的變化，偏離正常的生理狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)椴±硇越M合狀態(tài)，即菌群失調(diào)[1]，臨床上以腹瀉為明顯癥狀[2]。腸道菌群紊亂廣泛存在于動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐和臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，腸道菌群失調(diào)將直接破壞腸道機(jī)械屏障，通過(guò)維護(hù)調(diào)整腸道微生態(tài)，對(duì)于維持腸道黏膜屏障完整結(jié)構(gòu)和正常消化吸收功能無(wú)疑具有重要的意義。布拉迪酵母菌在腸道修復(fù)中有著重要的作用，布拉迪酵母菌與腸道黏膜相互作用，能防止病原體入侵，調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，減少炎癥物質(zhì)分泌，抑制細(xì)菌毒素作用并且加強(qiáng)小腸黏膜刷毛緣酶活性增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸[3]。本試驗(yàn)以添加氨芐青霉素造成肉鴨腸道菌群紊亂模型的肉鴨為研究對(duì)象，通過(guò)在飲水中用不同劑量的布拉迪酵母菌調(diào)節(jié)菌群紊亂肉鴨，測(cè)定肉鴨腸黏膜酶活性和腸黏膜蛋白質(zhì)、DNA以及RNA含量，為該微生態(tài)制劑的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品與日糧

氨芐青霉素購(gòu)自武漢市華順生物技術(shù)有限責(zé)任公司；布拉迪酵母菌由法國(guó)百科大制藥廠生產(chǎn)，試驗(yàn)用布拉迪酵母菌菌懸液108 CFU/L、109 CFU/L、1010 CFU/L。飼料配方見(jiàn)表1所示。

1.2 儀器與試劑

測(cè)定儀器：GHP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、YM50型全自動(dòng)電熱立式消毒器、全自動(dòng)生化分析儀、WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)、SPV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、HH-恒溫水浴鍋、IKA ULTRRAX-UT TD C（SO）型勻漿器等。

試劑盒：ATP酶測(cè)試盒、二糖酶（蔗糖酶、麥芽糖酶）測(cè)試盒、蛋白質(zhì)定量測(cè)試試劑盒，購(gòu)自南京建成科技有限公司。

其他：高氯酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

櫻桃谷肉鴨（1日齡），購(gòu)自武漢市春江禽業(yè)有限責(zé)任公司。將25只櫻桃谷肉鴨隨機(jī)分為對(duì)照組（5只）、抗生素組（20只）。櫻桃谷肉鴨菌群失調(diào)模型的建立需要10 d，具體參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]，菌群失調(diào)模型建立后，抗生素組分為4組，每組5只：即氨芐青霉素組，低劑量組（試驗(yàn)Ⅰ組）、中劑量組（試驗(yàn)Ⅱ組）、高劑量布拉迪酵母菌組（試驗(yàn)Ⅲ組），其中，氨芐青霉素組立即屠宰取樣并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)，其目的在于比較布拉迪酵母菌組與病理組間的區(qū)別以及布拉迪對(duì)病理黏膜的修復(fù)效果。各劑量布拉迪酵母菌組按每天200 mL/只飼喂各劑量酵母菌菌懸液，對(duì)照組自由飲水，各組連續(xù)飲用15 d。菌群失調(diào)模型成功建立后開(kāi)始飼喂布拉氏酵母菌記為修復(fù)試驗(yàn)的第一天。

1.4 飼養(yǎng)管理

按照常規(guī)肉鴨飼養(yǎng)方法，分0～3周齡和4～7周齡兩個(gè)時(shí)期飼養(yǎng)。試驗(yàn)前將鴨舍及附屬設(shè)備用福爾馬林和高錳酸鉀溶液消毒，使門(mén)窗完好、排水通暢，通風(fēng)保溫性能好。全期籠養(yǎng)，自由采食。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法

1.5.1 腸黏膜酶活性的測(cè)定 修復(fù)試驗(yàn)第16天屠宰試驗(yàn)鴨，取試驗(yàn)鴨的十二指腸、空腸、回腸，解剖各腸段，刮下腸黏膜，按照各種酶的測(cè)定方法的要求進(jìn)行勻漿，測(cè)定酶活性。

1）ATP酶活性的測(cè)定：南京建成ATP酶測(cè)試盒測(cè)定（十二指腸、空腸、回腸腸黏膜等量混合物）。

2）二糖酶（蔗糖酶、麥芽糖酶）活性的測(cè)定：南京建成二糖酶測(cè)試盒（A082-3）測(cè)定（十二指腸、空腸、回腸腸黏膜等量混合物）。

1.5.2 腸上皮細(xì)胞基因表達(dá)的測(cè)定

1）黏膜中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：南京建成蛋白質(zhì)定量測(cè)試試劑盒測(cè)定（十二指腸、空腸、回腸腸黏膜等量混合物）。

2）DNA、RNA含量的測(cè)定，按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行操作，步驟如下：①取2 mL 1%黏膜勻漿上清液，加入1 mL 0.6 moL/L的冷高氯酸中混勻；②冰上靜置10 min，充分溶解其樣本中蛋白質(zhì)，500 r/min離心10 min，棄上清液；③再用2 mL 0.2 mol/L的冷高氯酸洗滌2次，揮發(fā)余酸；加入2 mL 0.3 mol/L的氫氧化鉀，37 ℃下孵育60 min；④加入1 mL 1.2 mol/L的冷高氯酸，冰上靜置10 min，500 r/min離心15 min，收集此上清液a；⑤沉淀物再用2 mL 0.2 mol/L的冷高氯酸洗滌1次，再次離心收集上清液b，混合兩次上清液，用于RNA濃度的測(cè)定； ⑥將分離的RNA溶液于260 nm和232 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管吸光度。

計(jì)算RNA含量采用以下公式：

CRNA（μg/mL）=（3.4×OD260 nm-1.44×OD232 nm）/0.068

上述公式所得的結(jié)果再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得到原樣品的RNA濃度，結(jié)果以mg/g表示。

在以上步驟所剩余沉淀物中加入4 mL 1 mol/L的冷高氯酸，沸水浴中加熱10 min，500 g，離心20 min，除去變性蛋白，取上清液于260 nm、280 nm和320 nm，1 cm光徑，用1 mol/L的冷高氯酸調(diào)零，測(cè)各管吸光度。

計(jì)算DNA含量采用以下公式：

CDNA（μg/mL）=（OD260 nm-OD320 nm）×62.9-（OD280 nm-OD320 nm）×36.0

上述公式所得的結(jié)果再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得到原樣品的DNA濃度，結(jié)果以mg/g表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS17.0軟件中的平衡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析過(guò)程進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，均值的多重比較采用Duncans法和LSD法，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸黏膜ATP酶活性的影響

由表2可知，各組之間ATP酶活性的影響差異不顯著（P>0.05）。試驗(yàn)組Na+-K+-ATP酶活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05），各試驗(yàn)組與氨芐青霉素組相比均有提高。Mg2+-ATP酶活性各組之間差異不顯著（P>0.05）。Ca2+-ATP酶活性的研究結(jié)果顯示，氨芐青霉素誘導(dǎo)的肉鴨腹瀉模型中的Ca2+-ATP酶活力相對(duì)正常對(duì)照組下降，試驗(yàn)Ⅰ組酶活性有所上升；試驗(yàn)Ⅱ組酶活力上升明顯，但差異不顯著，試驗(yàn)Ⅲ組的Ca2+-ATP酶活與對(duì)照組相比提高了13.39%（P>0.05）。Mg2+-Ca2+-ATP酶活力與對(duì)照組、氨芐青霉素組相比均無(wú)顯著差異。

2.2 布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸黏膜雙糖酶活性的影響

雙糖酶位于小腸黏膜紋狀緣上，是重要的糖類(lèi)消化酶，雙糖酶的缺乏或活性降低均可引起雙糖分子在腸道內(nèi)水解減少，出現(xiàn)吸收障礙、腹瀉、消化不良等癥狀。繼發(fā)感染性腹瀉引起小腸黏膜受損后，導(dǎo)致雙糖酶活性下降。本研究中選取蔗糖酶和麥芽糖酶為對(duì)象，考察給菌群失調(diào)的肉鴨自由飲用不同劑量的布拉迪酵母菌對(duì)雙糖酶活性的影響。

由表4可知，與對(duì)照組相比，氨芐青霉素組與飼喂布拉迪酵母菌組的蔗糖酶活性均降低，表明抗生素導(dǎo)致的腹瀉可繼發(fā)雙糖酶活性下降。但是飼喂布拉迪酵母菌組之間與氨芐青霉素組相比，并未表現(xiàn)出顯著的劑量依賴(lài)關(guān)系，低、高劑量組的蔗糖酶活性顯著上升（P<0.05），中劑量組酶活上升程度緩慢；麥芽糖酶表現(xiàn)出顯著的劑量依賴(lài)關(guān)系，高劑量組酶活最高，可達(dá)30.50±2.07 U/（mg·prot）。據(jù)研究表明，雙糖酶活性與十二指腸黏膜的絨毛萎縮程度有相關(guān)性[6]，提示布拉迪酵母菌組具有調(diào)節(jié)絨毛形態(tài)均正常，增加雙糖酶活性。人類(lèi)志愿者和試驗(yàn)小鼠通過(guò)口服冷凍干燥制備的布拉迪酵母菌，在腸道內(nèi)能產(chǎn)生積極的效果，包括增加營(yíng)養(yǎng)吸收和腸道蠕動(dòng)、增加蔗糖酶、麥芽糖、糖化酶、乳糖、海藻糖、氨基肽酶、堿性磷酸酶在腸道上皮細(xì)胞及腔內(nèi)液中的含量，提高和加強(qiáng)sIgA分泌合成受體[7]。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，布拉迪酵母菌具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)雙糖酶的活性。

2.3 布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸黏膜細(xì)胞蛋白質(zhì)含量及基因表達(dá)的影響

2.3.1 布拉迪酵母菌對(duì)黏膜中蛋白質(zhì)含量的影響 由于上述幾種酶位于小腸細(xì)胞內(nèi)，因此通過(guò)對(duì)黏膜中總蛋白質(zhì)含量來(lái)間接反映總酶含量與上皮黏膜細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量。布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸道黏膜蛋白質(zhì)含量的影響見(jiàn)表4。由表4可知，試驗(yàn)Ⅱ組腸道黏膜蛋白質(zhì)含量最大即4.55 mg/mL，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組與氨芐青霉素組相比分別提高了3.49%（P>0.05）、32.27%（P<0.05）、11.34%（P>0.05），由此可以得到，酵母菌可以提高腸道黏膜中蛋白質(zhì)的含量。

2.3.2 布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸黏膜DNA、RNA含量的影響 RNA的含量與蛋白質(zhì)的合成代謝直接有關(guān)，RNA/DNA的增加，表明合成蛋白質(zhì)能力增強(qiáng)，生長(zhǎng)速度越快，試驗(yàn)Ⅱ組RNA/DNA最大，合成蛋白質(zhì)能力最強(qiáng)。布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸黏膜DNA、RNA含量的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，試驗(yàn)Ⅱ組提高量最為顯著；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ組提高了肉鴨腸道黏膜的DNA的含量，表明其有促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞增殖的作用。

3 討論

3.1 布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸黏膜酶活性的影響

小腸在食物消化吸收過(guò)程中占主導(dǎo)地位，小腸消化主要包括腸腔消化和黏膜消化，腸上皮的微絨毛上存在黏膜消化的酶類(lèi)，這些酶能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[8]。小腸黏膜中存在十二指腸腺和小腸腺[9]。日糧中的碳水化合物主要由多糖、寡糖、二糖和單糖組成，其中單糖可被直接吸入體內(nèi)，二糖則不能被小腸直接吸收。小腸黏膜上的二糖酶能將二糖水解成單糖后被機(jī)體吸收利用，由此可見(jiàn)，在碳水化合物的吸收利用中，小腸黏膜二糖酶有著極其重要的作用[10]。Buts等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)小鼠近回腸段切除后，連續(xù)8 d灌喂布拉迪酵母菌，橫斷組切除黏膜增生并顯著減少了蔗糖酶、乳糖酶和麥芽糖酶的活性；與橫斷組相比，布拉迪酵母菌組沒(méi)有影響?zhàn)つぴ錾黾与p糖酶的活性。ATP酶是組織細(xì)胞和細(xì)胞器的膜上的一種蛋白酶，在物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面有著極其重要的作用。有報(bào)道，釀酒酵母菌能夠使細(xì)胞質(zhì)中的Na+和K+含量維持在正常的使用范圍內(nèi)，包括血漿膜中的H+-ATP酶、Na+-ATP酶、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、K+（Na+）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的大小則是反應(yīng)能量代謝和功能有無(wú)損傷的一個(gè)重要標(biāo)志[13]，與電解質(zhì)和水的吸收有關(guān)。小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活性的高低反映小腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，該酶活力減少時(shí)，腸道對(duì)氨基酸、葡萄糖、Na+等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收減少，排除增多。小腸對(duì)糖和蛋白質(zhì)的吸收與鈉吸收偶聯(lián)，鈉泵分解ATP產(chǎn)生的能量以維持鈉和鉀的濃度[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母菌組修復(fù)菌群失調(diào)肉鴨后，對(duì)ATP酶活性無(wú)顯著影響，氨芐青霉素組對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力減弱，酵母菌提高了肉鴨對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。由酵母菌對(duì)菌群失調(diào)肉鴨的調(diào)整作用可見(jiàn)，酵母菌使肉鴨腸黏膜上蔗糖酶活性降低。中、高劑量布拉迪酵母菌組與對(duì)照組相比提高了麥芽糖酶活性，酵母菌可以提高肉鴨對(duì)麥芽糖的吸收能力。

3.2 布拉迪酵母菌對(duì)肉鴨腸黏膜細(xì)胞蛋白及基因表達(dá)的影響

腸黏膜中DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的含量改變可以反映細(xì)胞功能和形態(tài)的改變。RNA含量的增加，通常是指蛋白質(zhì)合成的增加，其一是黏膜內(nèi)蛋白質(zhì)增加，其二是參與機(jī)體黏膜內(nèi)蛋白質(zhì)黏膜合成過(guò)程中的蛋白酶的增加。黏膜內(nèi)的DNA和RNA含量的降低表明動(dòng)物腸黏膜細(xì)胞的增殖能力下降，損傷后修復(fù)過(guò)程減慢[14]。本研究中采用RNA/DNA的比值來(lái)評(píng)價(jià)酵母菌提高腸道黏膜蛋白質(zhì)含量的趨勢(shì)，中劑量布拉迪酵母菌促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞增殖的作用。

對(duì)菌群失調(diào)肉鴨連續(xù)飼喂布拉迪酵母菌15 d，酵母菌提高了肉鴨對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，并能在一定程度上提高腸黏膜上蔗糖酶、麥芽糖酶活性、各種ATP酶活性，中劑量組顯著提高黏膜中蛋白質(zhì)含量，并能促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞增殖。布拉迪酵母菌對(duì)腸道菌群失調(diào)有一定的修復(fù)作用，其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

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