暗紫貝母鱗莖的組織培養(yǎng)

張振霞　張惠婷　龐立志等

摘要：由于不合理的采挖，暗紫貝母野生資源奇缺，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以有效地保存暗紫貝母種質(zhì)資源，而且可以解決人工種植的種苗問題。以暗紫貝母鱗莖為外植體，通過選擇流水沖洗時(shí)間和消毒時(shí)間，研究不同激素組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果以及誘發(fā)產(chǎn)生不定芽或不定根從而長(zhǎng)成完整的植株的過程，以期建立暗紫貝母的快速無(wú)性繁殖體系。結(jié)果表明，以暗紫貝母鱗莖為外植體，先用流水沖洗3 h，經(jīng)75%乙醇表面消毒后，用0.10%氯化汞處理8 min，最后用無(wú)菌水清洗5次的效果最佳，污染率僅為7.5%；不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)66.7%；最佳繼代培養(yǎng)基配方同不定芽誘導(dǎo)，增殖系數(shù)可達(dá)8.27；在1/2MS+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上的生根情況較好。

關(guān)鍵詞：暗紫貝母；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基配方；鱗莖；不定芽；誘導(dǎo)；增殖；生根

中圖分類號(hào)： Q945.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0017-03

暗紫貝母（Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia）為著名中藥材川貝的主要來(lái)源之一，入藥部位為地下鱗莖，具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的功效[1]。暗紫貝母喜寒涼氣候，主要分布于四川省阿壩地區(qū)的海拔較高的高原與草地，生長(zhǎng)環(huán)境特殊，人工引種栽培有很多困難。另外，暗紫貝母生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，一般4～5年才可采收，而且產(chǎn)量很低，因此目前暗紫貝母的資源比較短缺，很大程度上都依賴于野生資源。經(jīng)過多年采挖，暗紫貝母的野生資源破壞嚴(yán)重，產(chǎn)量逐年減少，貨源緊缺，價(jià)格逐年攀升，因此尋找新的途徑以解決其資源問題是非常迫切的。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以從根本上解決暗紫貝母的苗種問題，成本低，見效快；此外，可以研究組培出來(lái)的暗紫貝母愈傷組織的藥效，有可能成為有效的替代技術(shù)。因此，暗紫貝母組培技術(shù)的研究在藥用植物開發(fā)研究和生產(chǎn)中具有特殊的意義和應(yīng)用潛力[2]，本研究探討不同植物激素組合對(duì)暗紫貝母鱗莖不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根情況的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

暗紫貝母地下鱗莖于2012年6月采自四川省康定地區(qū)。

以MS為基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂，調(diào)節(jié)pH值為5.8，添加不同濃度2，4-D、NAA、6-BA等激素。所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。

培養(yǎng)條件為溫度（25±1） ℃、空氣相對(duì)濕度50%～60%、光照時(shí)間12 h/d、光照度1 000～1 500 lx。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒 選取白嫩、健康的新鮮貝母地下鱗莖，用自來(lái)水沖洗1～2 h，置于超凈工作臺(tái)上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，采用5種方式對(duì)鱗莖外植體進(jìn)行消毒處理，分別為：處理1：流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+0.05%氯化汞浸泡、振蕩 8 min；處理2：流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 8 min；處理3：流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+10%次氯酸鈉浸泡、振蕩 20 min；處理4：流水沖洗3 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 8 min；處理5：流水沖洗3 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 10 min。消毒后用無(wú)菌水清洗5次后接種于附加不同激素組合的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，接種2周后統(tǒng)計(jì)污染率，以期篩選出適合的滅菌方式。

1.2.2 不同激素組合對(duì)暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)的比較 選用當(dāng)年生鱗莖作為外植體，將其切成0.5 cm大小、厚度0.2 cm左右，置于含NAA（0.5、2.0 mg/L）、6-BA（0.5、2.0 mg/L）、2，4-D（2.0 mg/L）、KT（1.0 mg/L）、TDZ（1.0 mg/L）的不同種類與濃度植物激素組合的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)周期為30 d，通過統(tǒng)計(jì)和對(duì)比誘導(dǎo)效率以及生長(zhǎng)狀況，研究不同激素種類與濃度組合對(duì)暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)的影響。

1.2.3 繼代培養(yǎng)的選擇 選用鱗莖誘導(dǎo)出的不定芽，轉(zhuǎn)移到含有NAA（0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L）的MS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基30塊，培養(yǎng)30 d后觀察記錄，比較NAA、6-BA對(duì)其繼代生長(zhǎng)的影響。

1.2.4 暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)生根培養(yǎng) 選取生長(zhǎng)較一致且健壯、未生根的綠色鱗芽單株，轉(zhuǎn)入含NAA（0.5、2.0 mg/L）、IBA（0.5 mg/L）、6-BA（0.5、2.0 mg/L）、KT（1.0 mg/L）、TDZ（1.0 mgl/L）的1/2MS、MS生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、出根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對(duì)暗紫貝母鱗莖消毒的效果

由于暗紫貝母的地下鱗莖帶菌嚴(yán)重，本研究采用不同的消毒方法對(duì)暗紫貝母鱗莖進(jìn)行了滅菌，2周后比較染菌率及存活狀態(tài)。從表1可以看出，處理4、處理5的滅菌效果比較好，但是從染菌率和暗紫貝母鱗莖存活狀態(tài)明顯可以看出，方法4更適合于暗紫貝母鱗莖器官的表面滅菌。因此認(rèn)為流水沖洗3 h、0.1%氯化汞滅菌8 min、無(wú)菌水清洗5次方法的滅菌效果最佳。

2.2 不同激素組合對(duì)暗紫貝母地下鱗莖誘導(dǎo)的影響

暗紫貝母鱗莖切片成大小為0.5 cm、厚度為0.2 cm左右，接種在含有不同植物激素的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d左右發(fā)現(xiàn)從貝母外植體切塊四周逐漸分化出小的不定芽，30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，詳見圖1。由表2結(jié)果可知，培養(yǎng)基中不同組合配比的植物激素對(duì)鱗莖的誘導(dǎo)效率不同：在含高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)NAA、2，4-D對(duì)于貝母鱗莖誘導(dǎo)都有明顯的促進(jìn)作用，其中MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 的出芽率達(dá)43.7%，且新生芽長(zhǎng)勢(shì)旺盛，數(shù)量多，較健壯，狀態(tài)佳。在2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，鱗莖外植體也誘導(dǎo)出不少的新生芽，只是芽較細(xì)小。在此基礎(chǔ)上各添加 1.0 mg/L KT或TDZ，對(duì)新生芽的誘導(dǎo)促進(jìn)作用并不明顯，但是個(gè)別外植體長(zhǎng)出淺黃色的根狀物；在含KT的培養(yǎng)基上，幾個(gè)新生芽變成綠色。綜合上述研究結(jié)果可知，選擇 MS附加2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA作為暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)芽的較優(yōu)激素組合培養(yǎng)基。

2.3 不定芽的繼代培養(yǎng)

將暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)分化出的不定芽轉(zhuǎn)移到含有不同濃度組合NAA、6-BA的MS培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種30個(gè)，培養(yǎng)10 d后就發(fā)現(xiàn)在外植體塊上長(zhǎng)出不少新芽（圖2）。35 d 后統(tǒng)計(jì)芽數(shù)，從表3可以看出：在不定芽繼代培養(yǎng)中，6-BA 和NAA的不同組合在一定程度上都能促進(jìn)暗紫貝母鱗莖不定芽的增殖，且隨著植物激素濃度的上升，增殖系數(shù)也提高；但是當(dāng)NAA、6-BA分別達(dá)到3.0 mg/L時(shí)，培養(yǎng)的不定芽出現(xiàn)一定程度的玻璃化現(xiàn)象，可見植物激素能促進(jìn)誘導(dǎo)貝母鱗莖生長(zhǎng)，但是使用濃度不能太高。最終選定2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最佳的繼代培養(yǎng)基激素組合，此條件下新生芽旺盛，增殖系數(shù)為8.27。

2.4 生根培養(yǎng)

本試驗(yàn)將以分化再生暗紫貝母鱗莖轉(zhuǎn)入到不同的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后觀察生根結(jié)果，詳見表4、圖3。在貝母鱗莖誘導(dǎo)增殖的培養(yǎng)過程中，MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上添加1.0 mg/L KT或1.0 mg/L TDZ，培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)鱗莖外植體周圍長(zhǎng)出許多鵝黃色、長(zhǎng)短粗細(xì)各異的不定根，可見貝母鱗莖生根相對(duì)容易。而在1/2MS生根培養(yǎng)基中，NAA和IBA的存在有利于生根，特別是在含 0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10d后就長(zhǎng)出健壯的根，約83.3%的鱗莖生根密集，長(zhǎng)勢(shì)好。在1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA和1/2MS+0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，生根效果也較好。綜合比較可知，貝母鱗莖生根對(duì)培養(yǎng)成分的要求不高，試驗(yàn)過程中基本都能生根，但1/2MS+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上生根率最高，長(zhǎng)出的根更加健壯，生根速率也快。生根后鱗莖長(zhǎng)出的綠芽見圖4。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同消毒方法的除菌效果

貝母地下鱗莖帶菌嚴(yán)重，通常的消毒方法往往難以取得滿意的效果。已有研究多數(shù)是用傳統(tǒng)的滅菌方法[3-5]，基本是采用70%的乙醇浸泡30 s，再用0.1%～0.2%的HgCl2處理5～8 min，最后用無(wú)菌水漂洗5～8次。本研究采用上述方法，但消毒效果都不甚理想，這主要由于貝母鱗莖通常都是 2～3 枚鱗葉相互合抱，加劇了外植體消毒處理的難度。而調(diào)整之后的消毒方法則取得不錯(cuò)的結(jié)果：將貝母地下鱗莖先用流水沖洗3 h以上，經(jīng)75%乙醇表面消毒后，再用 0.10%氯化汞振蕩8 min消毒處理，最后用無(wú)菌水清洗5次，獲得外植體的污染率為7.5%，同時(shí)且消毒劑對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響也較小。

3.2 不同激素配比對(duì)暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)增殖的影響

不定芽的產(chǎn)生主要取決于培養(yǎng)基的類型及植物激素種類與濃度的配比組合。李隆云等通過對(duì)暗紫貝母鱗莖再生組織培養(yǎng)技術(shù)的研究指出，NAA和KT的組合有利于鱗莖的誘導(dǎo)[3]。王躍華等認(rèn)為，2.0 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA組合為卷葉貝母鱗莖再生最佳條件[4]。高燕等研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D[5]。劉亞菊等研究了TDZ在平貝母組織培養(yǎng)中的作用，結(jié)果表明，TDZ在濃度很低時(shí)可刺激平貝母外植體脫分化和再分化[6]。選用NAA、6-BA、KT、TDZ、2，4-D這5種激素不同組合誘導(dǎo)出不定芽，結(jié)果表明，2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA組合誘導(dǎo)不定芽的生長(zhǎng)效果較好，同樣的培養(yǎng)基條件在繼代培養(yǎng)中的增殖系數(shù)為8.27，效果也最佳。

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