宇川川，賈桂燕，李麗陽(yáng)，阮洪生，趙竹青，崔玉，葛文中

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.齊齊哈爾市梅里斯區(qū)第二中學(xué)）

甾體的微生物轉(zhuǎn)化是一種有效且經(jīng)濟(jì)的能制備藥用活性成分的重要方法。存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的孕甾烯醇酮（Pregnenolone，PREG），對(duì)睡眠、細(xì)胞興奮性毒性等產(chǎn)生作用，在體內(nèi)可被代謝為20α-羥基化和7α-羥基化產(chǎn)物[1]。而7α-羥基孕甾烯醇酮能提高小鼠的免疫反應(yīng)[2]，具有抗糖皮質(zhì)激素的功效[3]，能提高空間記憶[4]，并可作為神經(jīng)元的激活劑去激發(fā)自主活動(dòng)[5]。

研究表明，F(xiàn)usarium oxysporum var.cubense[6]，Exophiala jeanselmei var.lecanii-corni[7]等菌株使孕甾烯醇酮發(fā)生7α-羥基化反應(yīng)，而孕甾烯醇酮分別被Mucor plumbeus[8]和 Mucor circi -nelloides var lusitanicus[9]轉(zhuǎn)化為7α，11β-和7α，11α-二羥基化產(chǎn)物。葛文中[10，11]利用Mucor racemosus 對(duì)一系列3-羥基-5-烯甾體進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，研究發(fā)現(xiàn)該菌株的生物轉(zhuǎn)化具有較強(qiáng)的規(guī)律性，都能專一性的發(fā)生7α 羥基化，C5-C6 雙鍵的形成對(duì)羥基化位置的引入有重要影響，C16-C17 雙鍵及16α，7α-環(huán)氧甾體發(fā)生16-甲氧基的新反應(yīng)。

林生毛霉可以分泌蛋白酶，應(yīng)用于腐乳的加工過(guò)程[12]，鮑松林等[13]對(duì)生產(chǎn)紹興腐乳的林生毛霉的蛋白酶進(jìn)行系統(tǒng)檢測(cè)研究。本研究利用M.silvaticus 對(duì)孕甾烯醇酮進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，采用IR、MS 和2D NMR等波譜方法對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，對(duì)13C 譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸屬，并詳細(xì)地解析了3β，7α，9α-三羥基-5-烯-20-酮，為系統(tǒng)分析甾體微生物轉(zhuǎn)化和其他甾體衍生物結(jié)構(gòu)鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

孕甾烯醇酮、林生毛霉（Mucor silvaticus AF 93204，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心）；發(fā)酵培養(yǎng)液：1 000 mL 水、12 g 蛋白胨、30 g 葡萄糖、1 g 酵母膏、1.3 g KH2PO4，用濃鹽酸調(diào)pH 為4.5；實(shí)驗(yàn)室所用各種試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

BIO-RAD 公司FTS-40 型紅外光譜儀，Bruker-Esquire3000 離子阱液相色譜質(zhì)譜儀，RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Bruker AVANCE DPX-400 超導(dǎo)核磁共振儀（樣品以DMSO-d6 為溶劑，TMS 為內(nèi)標(biāo)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取林生毛霉斜面菌種1 支，接種于含120 mL 培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶?jī)?nèi)。在28 ℃，180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)2 d。將1.5 g 孕甾烯醇酮底物溶于30 mL 丙酮中，向每瓶菌液中加入2 mL 的底物溶液，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)4 d。用紗布過(guò)濾發(fā)酵液，用乙酸乙酯分別萃取發(fā)酵液和菌絲體5 次，合并有機(jī)相。減壓蒸去溶劑，40 ℃真空干燥的粗品。以乙酸乙酯/石油醚=3/2（v/v）為洗脫劑，硅膠柱層析對(duì)粗品進(jìn)行分離。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)IR、ESI-MS 和2D NMR 等波譜方法確定結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

用林生毛霉對(duì)孕甾烯醇酮轉(zhuǎn)化時(shí)，得到了三個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。經(jīng)圖譜分別鑒定為7α-羥基孕甾烯醇酮（2）、7α，11α-二羥基孕甾烯醇酮（3）和7α，9α-二羥基孕甾烯醇酮（4），結(jié)構(gòu)式如下：

圖1 孕甾烯醇酮的生物轉(zhuǎn)化Fig.1 Biotransformation of pregenolone

孕甾烯醇酮1 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，得到化合物2、3 和4?；衔? 收率：6.4%，mp：183～184 ℃；IR（cm-1）：3 420，2 935，1 698，1 661，1 458，1 433，1 358，1 229，1 186，1 054；MS m/z 355 [M+Na]+，371 [M+K]+?；衔? 收率：42.3%；mp：279～281 ℃；IR（cm-1）：3 408，3 246，3 123，1 798，1 769，1 630，1 433，1 358，1 229，1 186，1 054；MS：m/z 371 [M+Na]+，387 [M+K]+?；衔? 收率：8.1%；mp：239～241 ℃；IR（cm-1）：3 511，3 291，2 960，2 933，2 897，1 693，1 635，1 381，1 364，1 064，1 025，538；MS m/z 371[M+Na]+，387 [M+K]+。

根據(jù)1H NMR、13C NMR 和2D NMR 譜圖，對(duì)化合物的13C NMR 譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸屬，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 化合物13C NMR 數(shù)據(jù)Table 1 13C NMR signals of compounds

表1 化合物13C NMR 數(shù)據(jù)Continued table 1 13C NMR signals of compounds

根據(jù)紅外、質(zhì)譜、1H NMR、13C NMR、DEPT、HMBC、HSQC 和1H-1H COSY 譜圖，對(duì)化合物4 進(jìn)行完全解析[14]。

在化合物4 的紅外中譜中，3 511 cm-1和3 291 cm-1兩處有吸收峰，是羥基的H-O 伸縮振動(dòng)。1 693 cm-1處的吸收峰，是羰基的C=O 伸縮振動(dòng)。1635 cm-1處的吸收峰，是不飽雙鍵的C=C 伸縮振動(dòng)，說(shuō)明A 環(huán)中3-羥基-5-烯的基本結(jié)構(gòu)仍然存在。

在化合物4 的ESI-MS 譜中，MS m/z 371（[M+Na]+），與底物妊娠烯醇酮的分子量相比增加了32 個(gè)質(zhì)子單位，表明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物4 比底物增加了兩個(gè)氧原子。

在化合物4 的13C NMR 譜中，存在δ 208.7 峰，為C-20 羰基。與底物相比，表明C-20 羰基未變。δ 141.2 和δ 123.5 的存在，表明保留了底物的5～6位雙鍵。1H NMR 譜中，根據(jù)峰形和質(zhì)子數(shù)目，可將低場(chǎng)的δ 5.47 直接歸屬為H-6，在HSQC 譜中與δ 5.47 相關(guān)聯(lián)的δ 123.5 歸屬為C-6，則δ 141.2 歸屬為C-5。DEPT 譜（圖5）顯示，化合物4 有3 個(gè)甲基信號(hào)和7 個(gè)仲碳，6 個(gè)叔碳，5 個(gè)季碳，與底物譜圖對(duì)比，少了一個(gè)叔碳信號(hào)，少了一個(gè)仲碳信號(hào)，多了一個(gè)季碳信號(hào)。

化合物4 的1H NMR 譜顯示，3 個(gè)甲基信號(hào)分別位于δ 0.52、δ 0.98 和δ 2.08 處。在HMBC 譜中（圖2）中，δ 0.98 處的甲基氫與δ 141.2（C-5）有相關(guān)聯(lián)的交叉峰，而δ 2.08 與δ 208.7（C-20）有交叉峰，因此，δ 0.98，δ 2.08 處的氫分別歸屬為H-19 和H-21，甲基氫δ 0.52 歸屬為H-18。HMBC 譜中H-21（δ 2.08）、H-18（δ 0.52）分別與δ 62.6 處的峰有相關(guān)偶合，根據(jù)DEPT 碳類型，可將δ 62.6 歸屬為C-17。由HSQC譜中（圖3），可將與δ 0.52（H-18）、δ 0.98（H19）和δ 2.08（H-21）相偶合的δ 12.3、δ 21.4 和δ 31.4 分別歸屬為C-18、C-19 和C-21。

圖2 化合物4 HMBC 譜圖Fig.2 HMBC spectrum of compound 4

圖3 化合物4 HSQC 譜圖Fig.3 HSQC spectrum of compound 4

在化合物4 的HMBC 譜中，H-18 應(yīng)與C-12，C-13，C-14 和C-17 有相關(guān)偶合。質(zhì)子H-18（δ 0.52）與δ 34.0、δ 43.4、δ 45.0 和δ 62.6 有交叉峰。根據(jù)DEPT 中碳的類型，δ 34.0 為仲碳，δ 43.4 為季碳，δ 45.0 為叔碳，δ 62.6 為叔碳。因此，δ 34.0、δ 43.4、δ 45.0 分別歸屬為C-12、C-13，C-14 峰。

在HMBC 譜中，H-19 應(yīng)與C-1，C-5，C-9 和C-10 有相關(guān)偶合。質(zhì)子H-19（δ 0.98）與δ 29.0，δ 42.4，δ 74.7，和δ 141.2 有交叉峰，DEPT 譜中顯示，δ 29.0 為仲碳，而δ 141.2、δ 64.7 和δ 42.4 處均為季碳，已推斷δ 141.2 為C-5 峰，δ 29.0、δ 42.4 分別歸屬為C-1、C-10 的化學(xué)位移。δ 74.7 峰為C-9 化學(xué)位移，推測(cè)C-9 中有一羥基相連，表明C-9 發(fā)生羥基化。由HSQC 譜可知，與δ 29.0（C-1）相關(guān)的氫δ 1.92歸屬為H-1。

在化合物4 的1H-1H COSY（圖4）譜中，δ 5.47處的H-6 與δ 3.74 處的氫有相關(guān)偶合，δ 3.74 可歸屬為H-7。由HSQC 譜中，δ 3.74（H-7）相關(guān)聯(lián)的δ 64.4 峰為C-7 化學(xué)位移。根據(jù)C-7 的13C NMR 值，結(jié)合DEPT 譜中碳類型推測(cè)，C-7 發(fā)生羥基化。

圖4 化合物4 1H-1H COSY 譜圖Fig.4 1H-1H COSY spectrum of compound 4

圖5 化合物4 的DEPT 譜圖Fig.5 DEPT spectrum of compound 4

在化合物4 的1H-1H COSY（圖4）譜中，δ 1.92（H-1）與δ 1.34 有相關(guān)偶合，可歸屬δ 1.34 為H-2化學(xué)位移。在HSQC 譜中δ 1.34 對(duì)應(yīng)的碳化學(xué)位移為δ 31.3，根據(jù)DEPT 譜中的碳類型，將δ 31.3 歸屬為C-2。1H-1H COSY 譜中，H-2（δ 1.34）不僅與δ 1.92（H-1）有相關(guān)偶合，而且與δ 3.32（H-3）有交叉峰，在HSQC 譜中與之相關(guān)聯(lián)的碳化學(xué)位移為δ 69.3，即為C-3 信號(hào)峰?？蓪?H-1H COSY 譜中與δ 3.32（H-3）有偶合的另一質(zhì)子δ 2.23 歸屬為H-4 化學(xué)位移，在HSQC 譜中與之對(duì)應(yīng)的δ 42.3 歸屬為C-4 化學(xué)位移。

在1H-1H COSY 譜中，δ 3.74（H-7）與δ 1.68，δ 4.80 和δ 5.47（H-6）處有偶合。在HSQC 中δ 1.68對(duì)應(yīng)的碳化學(xué)位移為δ 38.5，根據(jù)DEPT 譜中的碳類型，可將δ 38.5 歸屬為C-8。δ 4.80 在HSQC 中卻沒(méi)有相關(guān)聯(lián)的碳化學(xué)位移，而在HMBC 譜中與C-7（δ 64.4）有相關(guān)偶合，δ 4.80 峰為C-7 羥基中的氫。確定C-7 發(fā)生羥基化。

在化合物4 的HSQC 譜中，C-17（δ 62.6）相關(guān)聯(lián)的H-17 化學(xué)位移對(duì)應(yīng)為δ 2.65，在1H-1H COSY 譜中與δ 1.59 偶合，通過(guò)DEPT 和HSQC 歸屬δ 22.4為C-16 化學(xué)位移，由1H-1H COSY 及DEPT 中碳的類型推斷δ 23.7 為C-15 的化學(xué)位移。最后一個(gè)仲碳δ 26.4 直接歸屬為C-11。在HMBC 譜中，質(zhì)子δ 4.23與δ 74.4（C-9）和δ 26.4（C-11）有交叉峰，而在HSQC 中卻沒(méi)有相關(guān)聯(lián)的碳化學(xué)位移，因此，推斷C-9 羥基化。

生物轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，孕甾烯醇酮主要發(fā)生了7α-羥基化，并伴有C-9α 和C-11α 羥基化，其中主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為7α，11α-二羥基孕甾烯醇酮。3β-羥基-5-烯-甾體的微生物轉(zhuǎn)化中發(fā)生9α-羥基化的報(bào)道較少，Rhodococcus sp.對(duì)16α，17α-環(huán)氧妊娠烯醇酮具有較強(qiáng)的9α-羥基化位置選擇性[15]，Circinella sp.轉(zhuǎn)化多個(gè)3β-羥基-5-烯-甾體主要得到9α-羥基衍生物，9α-羥基化也是微生物降解甾體母核的關(guān)鍵反應(yīng)[16]。

3 結(jié)論

利用林生毛霉轉(zhuǎn)化孕甾烯醇酮得到了7α-羥基孕甾烯醇酮、7α，11α-二羥基孕甾烯醇酮和7α，9α-二羥基孕甾烯醇酮三種產(chǎn)物，其中7α，11α-二羥基孕甾烯醇酮的收率最大。通過(guò)DEPT 和1H-1HCOSY，HSQC，HMBC 等2D NMR 技術(shù)對(duì)產(chǎn)物13C NMR 數(shù)據(jù)進(jìn)行了全歸屬，利用IR、ESI-MS 和2D NMR 等波譜方法對(duì)7α，11α-二羥基孕甾烯醇酮的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的解析。

［1］Plassart S E，Baulieu E E.Neurosteroids：recent findings［J］.Brain Research Reviews，2001，37（1-3）：133-140.

［2］Morfin R，Lafaye P，Cotillon A C，et al.7α-Hydroxydehydroepiandrosterone and immune response［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，2000，917：971-982.

［3］Morfin R.7-Hydroxylated metabolites of circulating 3βhydroxysteroids are native anti-glucocorticoids［J］.Expert Opinion on Therapeutic Targets，1997，1（1）：245-248.

［4］Yau J L，Noble J，Graham M，et al.Central administration of a Cytochrome P450 -7B product 7α -hydroxypregnenolone improves spatial memory retention in cognitively impaired aged rats［J］.Neuroscience，2006，26（43）：11034-11040.

［5］Matsunaga M， Ukena K，Baulieu E， et al.7α -Hydroxypregnenolone acts as a neuronal activator to stimulate locomotor activity of breeding newts by means of the dopaminergic system［J］.Natl.Acad.Sci.，2004，101（49）：17282-17287.

［6］Wilson M R，Gallimore W A，Reese P B.Steroid transformations with Fusarium oxysporum var.cubense and Colletotrichum musae［J］.Steroids，1999，64：834 -843.

［7］Peart P C，McCook K P，Russell F A，et al.Hydroxylation of steroids by Fusarium oxysporum，Exophiala jeanselmei and Ceratocystis paradoxa［J］.Steroids，2011，76：1317 -1330.

［8］Lamm A S，Chen A R，Reynolds W F，et al.Steroid hydroxylation by Whetzelinia sclerotiorum，Phanerochaete chrysosporium and Mucor plumbeus ［J］.Steroids，2007，72：713-722.

［9］Shan L H，Liu H M，Huang K X，et al.Synthesis of 3β，7α，11α-trihydroxy-pregn-21-benzylidene-5-en-20-one derivatives and their cytotoxic activities［J］.Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters，2009，19：6637-6639.

［10］Ge W Z，Li N，Shan L H，et al.Microbial transformation of 4-ene-3-one steroids by Mucor racemosus［J］.Acta Microbiologica Sinica，2007，47（3）：540-543.

［11］Ge W Z，Wang S M，Shan L H，et al.Transformation of 3β-hydroxy-5-en -steroids by Mucor racemosus［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2008，55（1-2）：37-42.

［12］沈德中.海外腐乳的生產(chǎn)和研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，1989（7）：1-4.

［13］鮑松林，丁霄霖.紹興腐乳毛坯中蛋白酶的檢測(cè)［J］.無(wú)錫輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，13（4）：280-284.

［14］劉永剛，葛文中.去氫表雄酮生物轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物的波譜學(xué)結(jié)構(gòu)表征［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，22（1）：100-103.

［15］Angelova B，Mutafov S，Avramova T L.Stefanova effect of nitrogen source in cultivation medium on the 9α -hydroxylation of pregnane steroids by resting Rhodococcus.sp.cells［J］.Biotechnol and Biotechnol.，2005，19（3）：113-116.

［16］Lugauskas A，Repeckiene J，Novosinskas A.Micromycetes producers of toxins，detected on stored vegetables［J］.Ann Agric Environ Med，2005，12：253-260.