張璐瑩，羅春海，許啟有，李詩(shī)瑩，鄒曉，付世新

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

子宮內(nèi)膜炎是奶牛主要疾病之一，對(duì)畜牧經(jīng)濟(jì)有著直接的經(jīng)濟(jì)影響。子宮內(nèi)膜炎主要發(fā)生的原因?yàn)榧?xì)菌感染[1]，而目前臨床治療仍舊以抗生素為主要治療方法，伴隨著耐藥性和藥物殘留問題的日益凸顯，臨床治療上需要可以替代抗生素的新型藥物[2]。溶菌酶作為一種綠色藥物[3]，受到了人們的關(guān)注，其具有殺菌效果強(qiáng)、菌譜廣、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。以此為基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)室通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備了重組牛乳溶菌酶，并對(duì)其純化濃縮后獲得重組牛乳溶菌酶粉劑，不僅具有以上的生物學(xué)作用，同時(shí)具有同源性的優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)主要通過對(duì)牛乳溶菌酶進(jìn)行溶血試驗(yàn)和刺激性試驗(yàn)，進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步臨床試驗(yàn)提供保障和依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康白兔家兔6 只，體重2.0～2.5 kg。

1.2 溶菌酶

實(shí)驗(yàn)室制備的重組牛乳溶菌酶粉劑。

1.3 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的確定

2.1.1 牛乳溶菌酶溶液和菌液的制備

取實(shí)驗(yàn)室已獲得的純化濃縮后的重組牛乳溶菌酶粉劑，用蒸餾水配制成濃度為10.0 mg·mL-1的牛乳溶菌酶溶液[6]。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)，挑取少量單個(gè)菌落加入肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h，分別制成肉湯培養(yǎng)基。

2.1.2 牛乳溶菌酶抑菌效果的測(cè)定

取15 只試管于試管架上，分別加入已制成的含菌肉湯培養(yǎng)基1 mL。在1 號(hào)試管中加入1 mL 牛乳溶菌酶溶液，之后倍比稀釋，最后一支試管不加。再分別加入100 μL 金黃色葡萄球菌菌液，混勻。大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌同樣操作，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察并記錄結(jié)果。

2.2 牛乳溶菌酶溶血性試驗(yàn)

2.2.1 2%兔紅細(xì)胞混懸液的配制

健康家兔心臟取血20 mL，于帶有玻璃珠的錐形瓶中，振蕩搖晃10 min。將除去纖維蛋白原的血液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入10 mL 生理鹽水，混勻，2 500 r·min-1離心5 min。棄上清后加入生理鹽水，混勻后繼續(xù)離心。重復(fù)步驟，用生理鹽水洗滌3 次，至上清不為紅色為止。取管底2 mL 紅細(xì)胞液，與98 mL 生理鹽水配制成2%的兔紅細(xì)胞混懸液。

2.2.2 溶血試驗(yàn)

在試管架上排列7 支試管并標(biāo)號(hào)，將牛乳溶菌酶溶液、生理鹽水、2%兔紅細(xì)胞混懸液和蒸餾水按表1 加入試管中。其中，6 號(hào)試管不加牛乳溶菌酶溶液作為空白對(duì)照，7 號(hào)試管只加2%兔紅細(xì)胞混懸液和蒸餾水作為陽(yáng)性對(duì)照。將1～6 號(hào)試管置于37 ℃恒溫箱中，分別在1 h、2 h、3 h 時(shí)觀察并記錄溶液變化情況[7]。

表1 溶血試驗(yàn)各溶液加樣值Table 1 Sample solution of Hemolysis test

2.3 牛乳溶菌酶刺激性試驗(yàn)

選取正常健康白色家兔6 只，排除眼角膜、虹膜和結(jié)膜有病變和炎癥變化的，試驗(yàn)進(jìn)行自身對(duì)照。試驗(yàn)時(shí)在右眼滴加0.1 mL 生理鹽水，左眼滴加0.1 mL的牛乳溶菌酶溶液，然后使兔子閉合眼睛10 s 左右。在滴眼后2、6、12、24、48、72 h 對(duì)家兔左右眼進(jìn)行檢查，根據(jù)表2 進(jìn)行眼刺激反應(yīng)評(píng)分[8]，并按照表3 進(jìn)行眼刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。

表2 眼刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Score standard of eye irritative action

表2 眼刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Continued table 2 Score standard of eye irritative action

表3 眼刺激評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Level standard of eye irritative action

3 結(jié)果

3.1 牛乳溶菌酶抑菌效果的確定結(jié)果

抑菌試驗(yàn)結(jié)果，牛乳溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯，大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌的抑菌效果相對(duì)較弱。金黃色葡萄球菌從13 號(hào)試管開始出現(xiàn)渾濁，表明其中有細(xì)菌生長(zhǎng)，大腸桿菌和無(wú)乳鏈球菌分別從3 號(hào)和6 號(hào)開始出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)現(xiàn)象，具體抑菌結(jié)果見表4。

表4 牛乳溶菌酶抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of LYZ-1 bacteriostatic test

3.2 牛乳溶菌酶溶血性試驗(yàn)結(jié)果

在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)中除7 號(hào)試管的陽(yáng)性對(duì)照溶液呈澄明紅色外，其余6 支試管內(nèi)溶液均未呈澄明紅色，上層液體為無(wú)色透明，紅細(xì)胞全部下沉，振蕩搖晃試管可見紅細(xì)胞在溶液中均勻分散。溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，牛乳溶菌酶溶液無(wú)溶血和凝集作用。試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 溶血性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of hemolysis

3.3 牛乳溶菌酶刺激性試驗(yàn)結(jié)果

家兔左眼用藥后，在6 h 后有輕度的眼角膜充血現(xiàn)象，12 h 出現(xiàn)少量分泌物，無(wú)水腫現(xiàn)象，隨著時(shí)間的延后，刺激性逐漸減弱，24 h 后充血現(xiàn)象消失，但分泌物依然存在，48 h 后基本表現(xiàn)正常（見表6）。根據(jù)評(píng)分結(jié)果，牛乳溶菌酶對(duì)黏膜無(wú)刺激。

表6 牛乳溶菌酶刺激性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of eye irritetive action

4 討論

牛乳溶菌酶作為一種新型的生物制劑，應(yīng)用于臨床治療，不僅能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，還能增強(qiáng)牛自身的免疫力[9]，并且可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜的恢復(fù)[10]。奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌[11]，牛乳溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抑菌效果，對(duì)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌也有一定抑菌效果。根據(jù)藥典2010 版，試驗(yàn)進(jìn)行了動(dòng)物安全性試驗(yàn)，為牛乳溶菌酶應(yīng)用于臨床提供保障。易明梅等討論驗(yàn)證了溶菌酶基因藥物應(yīng)用于奶牛后，對(duì)乳汁、尿液以及其他分泌物、排泄物等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示溶菌酶基因藥物對(duì)環(huán)境同樣是安全的。因此，初步完成了牛乳溶菌酶應(yīng)用于臨床前的安全性試驗(yàn)，其臨床效果還有待臨床試驗(yàn)時(shí)進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。

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