金愛紅　周霞平　周鳳珍

[摘要] 目的 研究CD147在子宮內膜異位細胞中的表達情況，并探討其對子宮內膜細胞的遷移和凋亡的調節(jié)作用。 方法 選取2013年6～12月于本院進行診治的60例子宮內膜異位癥患者為實驗組，并以同期的60名不孕癥患者為對照組，然后取實驗組的異位內膜及對照組的正常子宮內膜進行檢驗，以實時熒光定量PCR法進行CD147的檢測，統(tǒng)計并比較實驗組進行抗體阻斷前后的HES細胞遷移率及基質金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達。 結果 實驗組CD147表達為（7.65±1.25），其明顯高于對照組（0.95±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；經(jīng)抗體阻斷后的HES細胞遷移率明顯低于阻斷前，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），阻斷前后MMP-2表達則無明顯差異（P>0.05）。 結論 CD147在子宮內膜異位細胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，其通過MMP-2非依賴性途徑來影響人子宮內膜上皮細胞HES的遷移，以達到參與疾病發(fā)生、發(fā)展的作用。

[關鍵詞] CD147；基質金屬蛋白酶2；HES細胞遷移率；子宮內膜異位癥

[中圖分類號] R711.71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）06（c）-0006-05

[Abstract] Objective To study the expression situation of CD147 in endometriosis，and investigate the regulating action of CD147 for the migration and apoptosis. Methods 60 patients with endometriosis in our hospital from June to December in 2013 were chosen as the experimental group，60 patients with infertility at the same time were chosen as the control group，then the ectopic endometrium of experimental group and normal endometrium of control group were detected，CD147 were detected with PCR real-time fluorescent quantitative method，and the HES cell migration rate and MMP-2 expression of experimental group were respectively analyzed and compared before and after the blocking antibodies. Results CD147 expression of experimental group was （7.65±1.25），and it was obviously higher than that of control group （0.95±0.14），with significant difference （P<0.01），and the HES cell migration rate of experimental group after the blocking antibodies was obviously lower than that before the blocking antibodies with significant difference （P<0.01），while the MMP-2 expression before and after the blocking antibodies had no obvious difference （P>0.05）. Conclusion CD147 in endometriosis shows high expression state，and it can influence the migration of human endometrial epithelial cell HES through the MMP-2 independent pathways，in order to participate in disease progression.

[Key words] CD147；MMP-2；HES cell migration rate；Endometriosis

子宮內膜異位癥是一種極為常見的婦科疾病，其在育齡婦女中的發(fā)生高達10%左右[1-3]，且其在近年來呈現(xiàn)升高的趨勢，對于本病發(fā)生發(fā)展過程中影響指標的研究也并不少見，其中子宮內膜異位癥細胞的遷移以及惡性侵襲行為是較受認可的一類說法。CD147是具有增強腫瘤細胞的侵襲能力的一類指標[4-7]，且其在子宮成纖維細胞中具有誘導基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達增加的作用[8-9]，但是對于其在子宮內膜異位癥中的變化研究卻極為不足，本文中筆者就CD147在子宮內膜異位細胞中的表達情況進行研究，并探討CD147對子宮內膜細胞的遷移和凋亡的調節(jié)作用。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年6～12月于本院進行診治的60例子宮內膜異位癥患者為實驗組，并以同期的60名不孕癥患者為對照組。對照組60名不孕婦女中，年齡22～42歲，平均（32.2±5.7）歲。觀察組60例子宮內膜異位癥患者中，年齡21～41歲，平均（32.5±5.6）歲；r-AFS分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期15例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。兩組年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。所有患者均有規(guī)律的月經(jīng)周期，且其子宮內膜組織均處于月經(jīng)周期中的增殖階段。研究對象術前3個月未用過任何激素治療或消炎劑治療。

1.2方法

取實驗組的異位內膜及對照組的正常子宮內膜進行檢驗，以實時熒光定量PCR法進行CD147的檢測，統(tǒng)計并比較實驗組進行抗體阻斷前后的HES細胞遷移率及MMP-2表達。

1.2.1 RNA提取和實時PCR分析 CD147的TaqMan5引物購自Applied Biosystems公司?？俁NA樣品由Trizol試劑（Invitrogen公司，美國加利福尼亞州）萃取。首先，取組織50～100 mg，剪碎，加入0.5 ml Trizol試劑勻漿，移入1.5 ml離心管中，再用0.2 ml Trizol沖洗勻漿器，劇烈震蕩15 s，4℃離心（14 000 r/min），10 min后，將上層水相轉移至1個1.5 mL的焦碳酸二乙酯處理的微量離心管中。為沉淀RNA，每1毫升Trizol試劑中加入0.5 ml異丙醇，加入到上層水相樣品，并在-20℃下作用10～30 min。將RNA在14 000 r/min離心10 min，取其沉淀，在4℃并用1 ml 75%的乙醇洗滌1次。將適量RNA溶解在無RNase水。將RNA濃度通過S2000紫外-可見分光光度計（Perkin-Elmer公司，美國）測定，采用iScript cDNA合成試劑盒（Bio-Rad公司，美國），1 μg總RNA被轉錄為cDNA。進行定量PCR時，1式3份，分別在Applied Biosystems 7500Fast實時PCR系統(tǒng)中進行。

1.2.2免疫印跡 HES細胞在裂解緩沖液（RAPI的緩沖液：50 mmol/L pH為8.0的Tris-鹽酸，150 mmol/L的NaCl，1%NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS）中提取。免疫印跡法分析參考文獻[10]所述進行。不同階段的總裂解物（每泳道40 μg）進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移到硝酸纖維素濾膜上（Schleicher & Schuel，Dasse，德國）。在TBST（50 mmol/L的Tris-鹽酸，150 mmol/L的NaCl，0.05%吐溫20，5%脫脂牛奶，pH 7.6）封閉孵育。加入一抗，在TBST+1.5%無脂牛奶中孵育1 h，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1 h。將膜用TBST洗滌3次，然后通過增強的化學發(fā)光法（Amersham公司，皮斯卡塔韋，新澤西州）進行檢測。

1.2.3 遷移實驗 該操作參考文獻[11]所述進行。將5×106細胞培養(yǎng)在6孔板中，直至單層細胞后，此時DMEM+10%FBS培養(yǎng)基被替換為用DMEM+1%FBS。加入10 μg/ml的正常小鼠抗-CD147單克隆抗體作為實驗組，加入10 μg/ml的小鼠IgG（Santa Cruz公司，CA，USA）作為陰性對照組。在24 h內，每間隔一段時間就計算遷移率，本研究采用至少5種成像技術計算量化每板的遷移率。

1.2.4 蛋白酶激活明膠酶譜 用抗-CD147抗體治療24 h，進行明膠酶譜分析MMP-2的表達和活性。樣品加入到含有7.5%SDS-聚丙烯酰胺和0.5%明膠的凝膠中進行電泳。凝膠結束后，加入2.5%的Triton X-100，在室溫下溫育30 min，棄除Triton X -100，將膠放入含有50 mmol/L的Tris-HCl（pH為7.5，200 mmol/L的NaCl，5 mmol/L的CaCl2和0.02%Brij35），37℃孵育過夜，然后用0.5%考馬斯亮藍G染色30 min，再用脫色液（50%%甲醇和10%乙酸）室溫作用30 min。明膠酶活性被可視化為藍色背景上的白色條帶，本實驗重復2次。

1.2.5 HES細胞的生存/凋亡測定 參考以往研究，CD147可以調節(jié)精母細胞的生存/凋亡[12]。因此，在本實驗中，筆者采用MTS實驗研究CD147對細胞生長的影響。加入10 μg/ml的抗CD147抗體后，觀察子宮內膜細胞的活性情況及其與時間的相關性。CD147阻斷后，HES細胞的活力下降，可能原因是抑制細胞增殖或增強細胞凋亡。為了區(qū)分這兩種可能性，筆者在HES細胞中加入10 μg/ml的抗CD147抗體，采用免疫印跡法測定Bax、caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）。

1.3統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 兩組研究對象內膜細胞CD147表達的比較

實驗組異位內膜內CD147表達為（7.65±1.25），明顯高于對照組（0.95±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（圖1）。

2.2 實驗組抗體阻斷前后HES細胞遷移率及MMP-2表達的比較

通過試驗研究比較顯示，實驗組經(jīng)抗體阻斷后的HES細胞遷移率明顯低于阻斷前，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），使用特異抗人CD147加入體外子宮內膜上皮細胞抗體阻斷CD147功能，進行細胞遷移試驗，培養(yǎng)24 h后，加入CD147抗體后，細胞遷移距離為（150.9±10.0）μm，加入IgG抗體的細胞遷移距離為（266.8±11.5）μm，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（圖2），而阻斷前后MMP-2表達差異則無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖3），提示CD147功能的干擾并沒有改變HES細胞的MMP-2的活性。

2.3體外抑制CD147功能對HES細胞凋亡的影響

當加入10 μg/ml的抗CD147抗體后，子宮內膜細胞活性被明顯抑制，并且呈現(xiàn)時間相關性，這表明，CD147是參與調節(jié)HES細胞的生存/凋亡（圖4A）。在HES細胞加10 μg/ml的抗CD147抗體后，Bax蛋白表達、caspase-3和PARP均顯著上調，而總caspase-3的表達沒有顯著變化。這些結果表明，CD147阻斷后，HES細胞凋亡增強（圖4B）。

3討論

雖然已有研究表明CD147在子宮內膜異位癥中的表達增加[13-14]，但目前尚無CD147在子宮內膜細胞中的定量研究，且CD147在子宮內膜上皮細胞中的功能尚不清楚。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)CD147在60名女性卵巢子宮內膜異位病灶組織中表達明顯增高，這是第1個相對較大樣本量的定量研究。此外，本研究表明，在體外子宮內膜細胞中加入CD147抗體可抑制細胞遷移并加強細胞凋亡，提示CD147其在子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。

研究表明，CD147的過表達可以增強腫瘤細胞的侵襲能力，在癌癥的發(fā)展過程中起重要作用[15-16]。最近，還報道了精子發(fā)生中CD147可調節(jié)生殖細胞的遷移和凋亡[17]。在女性生殖道，CD147表達在卵巢[5]、胎盤和胎膜[7]、子宮[6]。還有一些研究已經(jīng)表明，CD147表達在人子宮內膜間質和腺上皮，如Braundmeier等[8]報道CD147表達定位于成纖維細胞和子宮內膜上皮細胞。值得注意的是，在人子宮內膜中，CD147的表達隨著月經(jīng)周期的不同而表達于不同的細胞中。在月經(jīng)周期的增殖期，CD147表達明顯增加，提示CD147可能參與了子宮內膜細胞增殖的調控。在本實驗中筆者已經(jīng)證明，加入CD147抗體后，子宮內膜細胞的存活率顯著下降，細胞凋亡顯著增加。細胞凋亡是用于保持組織的自我平衡狀態(tài)的關鍵的細胞機制。越來越多的研究表明，通過細胞凋亡，可在月經(jīng)周期中消除衰老的細胞，以維持子宮內膜的動態(tài)平衡。早在1998年，有學者發(fā)現(xiàn)在子宮內膜異位癥患者中，子宮內膜細胞的凋亡減少，表明增強在位內膜細胞的存活可能增加子宮內膜異位癥發(fā)病的可能性[18]。近期有研究表明，子宮內膜異位癥患者中，子宮內膜表現(xiàn)出較高水平的增殖活性和較低水平的凋亡相關蛋白[19]。然而，如何導致子宮內膜細胞存活增強的機制尚不清楚。本研究顯示，CD147在卵巢子宮內膜異位組織表達明顯增加，并且在子宮內膜上皮細胞中使細胞存活增加，提示CD147可能促進子宮內膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

一些研究已經(jīng)表明，MMP-2是在子宮內膜細胞重塑過程中發(fā)揮誘導和激活的作用。最近的一項研究表明，CD147的可溶性形式由子宮內膜上皮細胞分泌，刺激子宮間質成纖維細胞分泌MMP-2[20]。此外，有學者已經(jīng)證明，CD147在體外培養(yǎng)的牛上皮內膜細胞中，可促進MMP-2和MMP-14的表達[21]。根據(jù)基質金屬蛋白酶在細胞遷移中的作用，筆者推測CD147與細胞遷移相關，這是子宮內膜異位癥發(fā)病的關鍵。在本研究中，筆者已經(jīng)證明，加入CD147抗體后，子宮內膜細胞遷移顯著減少。不過MMP-2的表達和活性沒有明顯變化，提示CD147在子宮內膜細胞遷移中的作用是通過其他機制介導的。子宮內膜上皮細胞分泌CD147，一方面促進子宮內膜間質細胞分泌基質金屬蛋白酶；另一方面，加速細胞存活及遷移，同時通過目前尚不清楚的機制在上皮細胞和基質細胞之間相互作用，從而在子宮內膜異位癥的進展中起了關鍵作用。

總之，在卵巢子宮內膜異位癥的發(fā)展過程中，CD147參與了細胞凋亡的調控，在卵巢子宮內膜異位癥細胞凋亡和遷移過程中起了重要作用。進一步研究CD147在子宮內膜異位癥患者子宮內膜的表達，可能會更好地闡明其分子發(fā)病機制，并有助于評估子宮內膜異位癥的治療效果。

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（收稿日期：2015-02-05 本文編輯：衛(wèi) 軻）