張立強(qiáng)等

摘要：分離得到一株可產(chǎn)生紅色素的真菌，序列分析顯示該真菌的18S rDNA與黑曲霉菌（Aspergillus niger）的重疊群序列An03c0110、An03c0100的一致性達(dá)到100%，因此將此真菌初步鑒定為黑曲霉菌。通過分析紅色素特征吸光度的變化，研究了溫度、pH變化對(duì)色素穩(wěn)定的影響，結(jié)果顯示該色素在溫度10～100 ℃，pH 5～9條件下保持穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：黑曲霉菌（Aspergillus niger）；紅色素；穩(wěn)定性；18S rDNA

中圖分類號(hào)：S948 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）12-2863-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.013

Characterization of a Red Pigments Producing Fungus and Study

on the Stabilty of the Red Pigments

ZHANG Li-qiang1，LIANG Hua-bing2，AI Tao-shan1，YU Yun-zhen1，DING Gui-zhen1，ZHANG Guang-hua1

（1. Wuhan Fishery Science Research Institute， Wuhan 430207， China；

2. College of Life Science， South-Central University for Nationlities， Wuhan 430074， China）

Abstract： A strain of red pigments producing fungus was isolated in this research. 18S rDNA sequence analysis revealed homology 100% identities with Aspergillus niger contig An03c0110 and Aspergillus niger contig An03c0100， so this fungus was identifyed as an Aspergillus niger strain. The stability of this red pigments under different temprature and pH were studied by analyzing its specific abosorbance. The red pigments were stable under the condition of 10～100 ℃ and pH 5.0～9.0.

Key words： Aspergillus niger；red pigments；stability；18S rDNA.

天然紅色素大多來源于天然植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、動(dòng)物和微生物等的天然色素，生產(chǎn)量低，來源復(fù)雜，獲取麻煩，天然色素色澤不穩(wěn)定，在其使用過程中容易受各種因素的影響而發(fā)生褪色、變色等方面的變化，而影響其著色效果，嚴(yán)重制約了天然色素代替人工合成色素的進(jìn)程[1，2]。人們很早就知道真菌能產(chǎn)生顏色各異的色素，但主要作為分類鑒定指標(biāo)，并未認(rèn)識(shí)到真菌色素的應(yīng)用價(jià)值。真菌色素種類繁多，利用真菌生產(chǎn)天然色素有很多優(yōu)勢(shì)，例如生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)、易于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等。因此，應(yīng)用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)真菌色素不僅可以克服生產(chǎn)天然植物色素和動(dòng)物色素的缺點(diǎn)，還可以節(jié)約寶貴的自然資源，降低生產(chǎn)成本[3]。因此，利用微生物資源，尤其是真菌資源越來越受色素生產(chǎn)廠商的青睞。

目前對(duì)真菌色素的研究相對(duì)較少，特別是產(chǎn)紅色素真菌的報(bào)道僅集中在產(chǎn)紫青霉（Penicillium purpurogenum）[4]、草酸青霉（Penicillium oxalicum）[5]、紅曲霉（Monascus purpureus Went.）[6]、擬分枝孢鐮刀菌（Fusarium sporotrichioides）[7]、偏側(cè)蛇蟲草菌（Ophiocordyceps unilateralis）[8]等幾種真菌上，在黑曲霉菌（Aspergillus niger）中尚未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紅色素的報(bào)道。本研究分離得到一株可產(chǎn)紅色素的真菌，為了更好地獲得紅色素，本研究對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。色素的穩(wěn)定性是色素應(yīng)用中的重要問題，色素穩(wěn)定性的好壞將直接影響到著色物質(zhì)的色澤和品質(zhì)，本研究測(cè)定了紅色素的特征吸光度，并進(jìn)一步研究了溫度和pH變化對(duì)吸光度的影響，以此評(píng)價(jià)紅色素的穩(wěn)定性，為色素的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。為了確定該真菌的種屬，本研究通過18S rDNA序列對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究菌株源自玫瑰愈傷組織培養(yǎng)時(shí)可使培養(yǎng)基變紅的一株絲狀污染真菌。CTAB、蛋白酶K；Tris、EDTA、β-巰基乙醇購(gòu)于華美生物工程公司；DL2000、T載體，PCR體系、目的片段回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖購(gòu)自Bio-west公司；馬鈴薯為市售；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌株產(chǎn)紅色素培養(yǎng)基優(yōu)化

分別采用MS培養(yǎng)基；2倍有機(jī)物MS培養(yǎng)基； 3倍有機(jī)物MS培養(yǎng)基，pH 7.0，于28 ℃條件下培養(yǎng)并觀察記錄結(jié)果。

1.3 紅色素穩(wěn)定性分析

1.3.1 紅色素溶液的分離及除糖 將固體培養(yǎng)基倒出，去除表面菌體，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至燒杯中攪碎，抽濾得到紅色液體，將此紅色溶液離心取上清，用0.45 μm濾膜過濾，裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)40 ℃條件下濃縮，取3支50 mL離心管，分別加入5 mL濃縮液和45 mL無水乙醇，產(chǎn)生淺紅色絮狀物，振蕩后放入離心機(jī)4 000 r/min條件下離心4 min，取上清液再次旋蒸，得到除糖濃縮液，溶液于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 紅色素的最大吸光度檢測(cè) 取上述已經(jīng)處理過的紅色素，以水作為對(duì)照組，利用紫外分析儀在波長(zhǎng)為400～550 nm間進(jìn)行吸光度測(cè)定，并記錄。

1.3.3 紅色素的耐溫測(cè)試 取紅色素溶液3 mL，稀釋10倍后分裝于10個(gè)5 mL的試管中，每管3 mL，標(biāo)記號(hào)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。分別放置于10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 ℃水浴條件下處理30 min，觀察并記錄溶液顏色及吸光度[9]。

1.3.4 紅色素耐酸堿測(cè)試 取上述處理過的紅色素分別在pH 2、pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11條件下測(cè)定其吸光度并觀察其顏色的變化[10]。

1.4 真菌DNA的提取

采用CTAB法提取該真菌的基因組[11]。

1.5 真菌分子鑒定

引物合成及擴(kuò)增：引物為18S rDNA通用引物：NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用PTC-100型擴(kuò)增儀（美國(guó)MJ公司）進(jìn)行序列擴(kuò)增。20 μL的PCR反應(yīng)體系包括DNA模板2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，上下游引物各0.5 μL和 Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 14 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中檢測(cè)產(chǎn)物的特異性。

運(yùn)用PCR產(chǎn)物回收試劑盒（南京金斯瑞生物科技有限公司）純化回收目的DNA片段，送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，利用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生理性質(zhì)的研究結(jié)果

2.1.1 菌株不同培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果 由表1可知，菌體生長(zhǎng)到一定階段產(chǎn)生紅色素，且顏色逐漸加深至紅色。同時(shí)，研究表明，提高M(jìn)S培養(yǎng)基中的有機(jī)物含量至2倍時(shí)可以獲得最佳的紅色素產(chǎn)生效果，即在MS（有機(jī)物擴(kuò)大2倍）培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)5 d可獲得最佳紅色素產(chǎn)生效果。更高的有機(jī)物的濃度可為真菌的生長(zhǎng)提供更好的營(yíng)養(yǎng)需求，但有機(jī)物濃度上升的同時(shí)帶來了滲透壓的問題，本研究表明，將MS培養(yǎng)基的有機(jī)物濃度提高至兩倍最適合菌體生長(zhǎng)。

2.2 紅色素的性質(zhì)研究

2.2.1 紅色素的最大吸光度檢測(cè) 紅色素的測(cè)定結(jié)果見圖1，其最大紫外吸光度為0.29，該處波長(zhǎng)為500 nm。

2.2.2 紅色素的耐溫測(cè)試 紅色素隨著溫度的升高其吸光度無明顯差別，同時(shí)顏色也基本無變化（圖2），這表明試驗(yàn)所得紅色素為一種熱穩(wěn)定的物質(zhì)。

2.2.3 紅色素液體pH穩(wěn)定性 紅色素溶液pH 5～9時(shí)，隨著pH的增大紅色素吸光度在0.29上下波動(dòng)，變化不明顯。隨著pH的下降，吸光度也隨之下降，當(dāng)pH 3時(shí)降到最低（圖3），總體來看，試驗(yàn)所得紅色素對(duì)pH變化不敏感。

2.3 真菌18S rDNA序列分析

PCR擴(kuò)增得到一條特異性的18S rDNA片段（圖4），此序列經(jīng)過T-A克隆、測(cè)序最終確定其長(zhǎng)度為1 770 bp，Blast比對(duì)結(jié)果顯示該序列與黑曲霉菌序列An03c0110和An03c0100的18S rDNA序列的Query coverage為100%，E value為0，Max ident為100%，因此可以確定該真菌是一種黑曲霉菌，或是它們的一個(gè)變種。

3 討論

真菌作為一種重要的色素產(chǎn)生菌在其他研究中早有報(bào)道，如鏈霉菌、三孢布拉霉菌、產(chǎn)紫青霉等[3，4]，本研究發(fā)現(xiàn)的這株產(chǎn)紅色素的菌類是對(duì)產(chǎn)色素菌的進(jìn)一步豐富。18S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示該霉菌屬于黑曲霉菌，其最適產(chǎn)紅色素的培養(yǎng)基為有機(jī)物濃度提高了2倍有機(jī)物MS培養(yǎng)基，這提示該紅色素很可能是一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，該物質(zhì)產(chǎn)量隨著有機(jī)物濃度的提高而上升，但是更高的有機(jī)物濃度也帶來了更高的滲透壓，導(dǎo)致在3倍有機(jī)物MS培養(yǎng)基中色素產(chǎn)量反而不及在2倍有機(jī)物MS培養(yǎng)基中色素的產(chǎn)量。紅色素穩(wěn)定性研究表明，該色素具有耐溫性質(zhì)，在100 ℃條件下均未表現(xiàn)出明顯的性質(zhì)變化，耐酸堿試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)在pH 5～9時(shí)均表現(xiàn)較穩(wěn)定，這可能與該色素為一種小分子代謝產(chǎn)物有關(guān)。接下來的研究將進(jìn)一步確定紅色素的成分，為天然紅色素的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

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