陳英 楊偉球 邱學林 林惠菲

摘要：以黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）為代表的白腐真菌，其分泌的木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）等酶系能降解木質素以及前體類似物。對幾種無機金屬離子、無機陰離子、有機小分子對黃孢原毛平革菌所產酶系中的木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的酶活性影響進行了分析。結果表明，Fe3+對木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）都有很強的抑制作用，Fe2+、Ca2+對木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）表現出不同的促進作用，Br-比Cl-的激活作用稍弱；在添加乙二胺四乙酸（EDTA）或抗壞血酸的條件下，限氮培養(yǎng)比富氮培養(yǎng)更能提高出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活力。

關鍵詞：黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）；木質素過氧化物酶；錳過氧化物酶；酶活力

中圖分類號：O629.8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2878-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.017

Impact of Inorganic Ions and Organic Small Molecules on Enzymatic

Activity of Phanerochaete chrysosporium

CHEN Ying，YANG Wei-qiu，QIU Xue-lin，LIN Hui-fei

（Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture， Suzhou 215008， Jiangsu， China）

Abstract：As the representative of White-rot Fungus，Phanerochaete chrysosporium can secrete Lignin peroxides and Manganese peroxides and so on，which can depredate Lignin and Precursor analogs. Through using Inorganic ions and Organic molecules as Activator， enzyme activity in different conditions was researched.The results show that Fe3+ on LiP and MnP had strong inhibitory effect，but Fe2+ and Ca2+ on those showed different promoting effect. Br- can improve the enzyme activity better than Cl-. In addition of EDTA or ascorbic acid conditions，the nitrogen limited culture than nitrogen rich culture can improve the enzyme activity of the strains.

Key words：Phanerochaete chrysosporium；lignin peroxides；manganese peroxides；enzymatic activity

木質素是一類以苯丙烷為基本結構單元構成的復雜的芳香族高分子化合物，廣泛存在于植物細胞中，是地球上僅次于纖維素的最為豐富的有機再生資源。木質素在植物體內通過化學鍵和半纖維素連接，然后包裹在纖維素外，形成木質纖維素。木質素由于具有各種生物學穩(wěn)定的復雜鍵型而不易被微生物降解。要解決如何高效利用木質纖維素這一問題，關鍵在于如何降解包裹在纖維素晶體外面的木質素以及半纖維素，從而增加纖維素表面積，使纖維素易于降解和利用[1]。隨著人類可利用資源的越來越緊缺，木質素的微生物降解成了當今研究的熱點。白腐真菌作為已知的惟一可獨立降解木質素的微生物，其能分泌木質素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）等酶降系統(tǒng)[2-8]。黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）是常見的白腐真菌之一，在其整個生長階段中，木質素過氧化物酶的合成量要比錳過氧化物酶大得多，其在木質素降解中起主要作用。幾乎所有的木生白腐菌和各種土壤中的枯葉分解真菌都能產生錳過氧化物酶，其是最為普遍的木質素修飾過氧化物酶[9-11]。

本試驗研究了幾種無機金屬離子、無機陰離子、有機小分子對黃孢原毛平革菌所產酶系中的木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的酶活性影響，以期為大規(guī)模應用提供一定的參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 黃孢原毛平革菌購于中國科學院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體PDA培養(yǎng)基： 土豆浸出液200 g，葡萄糖20 g， 瓊脂20 g； 液體培養(yǎng)基： 葡萄糖（碳源）10 g/L、 酒石酸銨（氮源）1.2 mmol/L、 醋酸-醋酸鈉緩沖液0.2 mol/L、 KH2PO4 2.0 g/L、 CaCl2 0.130 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、吐溫-80 0.5 g/L、維生素A 0.4 mmol/L以及微量元素混合液10 mL；微量元素混合液： MnSO4 2.9 mmol/L、CaCl2 1.0 mmol/L、NaCl 0.15 mmol/L、 NaBr 0.15 mmol/L、ZnCl2 0.345 mmol/L、 FeSO4 0.358 mmol/L、 CuSO4 0.4 mmol/L、CoCl2·6H2O 0.458 mmol/L、 KAl（SO4）2·12H2O 0.022 mmol/L、 HBO3 0.16 mmol/L、 NaMoO4·2H2O 0.042 mmol/L，抗壞血酸10 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）10 mL。

1.1.3 儀器設備 752型紫外-可見分光光度計，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，YXQ-LS-50S型立式壓力蒸汽滅菌器，SHZ型水浴恒溫振蕩器。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗酶液的制備 將黃孢原毛平革菌接種在固體PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待菌種長滿整個平板后取8 mm菌塞， 取液體培養(yǎng)基100 mL，裝入250 mL三角瓶中，接入菌塞2個， 30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。 選取黃孢原毛平革菌第8 d的培養(yǎng)液經4 000 r/min、15 min離心后取上清液作為粗酶液。

1.2.2 酶活測定 木質素過氧化物酶（LiP）： 50 mmol/L的酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（pH約2.5）、 去離子水、 2 mmol/L的蔾蘆醇、4 mmol/L H2O2以及一定量的粗酶液，用紫外-可見分光光度計檢測310 nm處在2.5 min內吸光度變化。將1 μmol/min蔾蘆醇氧化成蔾蘆醛所需的酶量為1個酶活力單位。

錳過氧化物酶（MnP）：50 mmol/L的酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（pH約5.0）、 1.6 mmol/L H2O2、6 mmol/L MnSO4以及一定量的粗酶液，用紫外-可見分光光度計檢測310 nm處在4 min內吸光度變化，將1 μmol/min Mn2+氧化為Mn3+所需的酶量為1個酶活力單位。

木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的性質測定方面，分別選擇Na+、 K+、 Mg2+、Ca2+、 Fe3+、 Fe2+、 Zn2+、 Cu2+、 Ag+等金屬離子，陰離子NO3-、 Cl-、 Br-以及乙二胺四乙酸（EDTA）、 抗壞血酸作為效應物。在酶活力測試體系中， 加入不同濃度的效應物， 測定酶的相對活力。

2 結果與分析

2.1 不同金屬離子對酶活力的影響

向反應體系中加入濃度為50 mmol/L金屬離子溶液，使反應體系金屬離子終濃度為5 mmol/L，預熱至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL啟動反應，測定反應最初3 min內λ=240 nm處吸光度變化。其余金屬離子在相同溫度、pH條件下測定酶活力[12]，結果如圖1、圖2所示。

由圖1可知，隨著Ca2+濃度的增加，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力增加，這說明Ca2+對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活有一定促進作用。而隨著Na+濃度的增加，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力減小，這說明Na+對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活有一定抑制作用。而隨著K+和Mg2+濃度的增加，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力變化不明顯。Zn2+只有在濃度達到24 mmol/L才表現出明顯的促進作用，隨之到達28 mmol/L，又迅速降到原來水平。而隨著Fe2+濃度從4 mmol/L增加到24 mmol/L，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力由慢而快地增大，超過12 mmol/L，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力又由快到慢地降到原來水平，這說明Fe2+濃度為12 mmol/L時，酶活力最高。Fe3+則是隨著濃度的增加，到28 mmol/L時，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力近乎降到0，這說明Fe3+對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力有一定抑制作用。在4～8 mmol/L時，隨著Cu2+濃度的增加，酶活力也增加；當Cu2+濃度為8 mmol/L時，酶活力最高；8 mmol/L之后，酶活力隨著Cu2+濃度的增加而降低。而Ag+濃度幾乎不影響木質素過氧化物酶（LiP）的酶活性。

由圖2可知，在同樣條件下，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力也隨金屬離子濃度改變而改變。隨著Ca2+濃度的增加，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力逐漸增加，這說明Ca2+對錳過氧化物酶（MnP）的酶活力也有一定促進作用。而隨著Na+濃度的增加，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力減小，這說明Na+對錳過氧化物酶（MnP）的酶活力也有一定抑制作用。而隨著K+和Mg2+濃度的增加，錳過氧化物酶（MnP）的酶活力也變化不明顯。Zn2+只有在濃度達到24 mmol/L才表現出明顯的促進作用，到達28 mmol/L后又迅速降到原來水平，這點與對木質素過氧化物酶（LiP）的作用類似。但是，較對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力影響有所不同的是，Fe2+始終對錳過氧化物酶的酶活力起促進作用，而且錳過氧化物酶（MnP）的酶活力與濃度成正比。Fe3+對錳過氧化物酶（MnP）的酶活力也有一定抑制作用，而且錳過氧化物酶（MnP）的酶活力與Fe3+濃度成反比。在4～8 mmol/L時，隨著Cu2+濃度的增加，酶活力也增加，當Cu2+濃度為8 mmol/L時，酶活力最高；8 mmol/L之后，酶活力隨著Cu2+濃度的增加而降低，這與對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力影響比較分析，其結果近乎類似。而Ag+濃度也幾乎不影響錳過氧化物酶（MnP）的酶活力。

2.2 不同陰離子對酶活力的影響

向反應體系中加入濃度為50 mmol/L陰離子表面活性劑，使反應體系陰離子終濃度為5 mmol/L，預熱至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL啟動反應，測定反應最初3 min內λ=240 nm處吸光度變化。其余陰離子在相同溫度、pH條件下測定酶活力[12]，結果如圖3所示。

由圖3可知，陰離子表面活性劑對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力有明顯的影響。在15～30 mmol/L時，隨著Br-和Cl-濃度的增加，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力升高，這說明Br-和Cl-對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力有一定促進作用。在30～105 mmol/L時，隨著Br-和Cl-濃度的增加，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力降低，酶活力與濃度關系成反比，這說明Br-和Cl-對木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力有一定抑制作用。結果表明，當30 mmol/L時，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力達到最大，但是對其作用方向是激活或是抑制沒有統(tǒng)一的結果，只是Br-比Cl-的激活作用稍弱。而隨著NO3-濃度的增加，木質素過氧化物酶（LiP）的酶活力變化不明顯。

2.3 不同有機小分子對酶活力的影響

2.3.1 乙二胺四乙酸對酶活力的影響 在富氮和限氮培養(yǎng)基中分別添加0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的乙二胺四乙酸（EDTA），37 ℃培養(yǎng)7 d后分別測定出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活力，預熱至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL啟動反應，測定反應最初3 min內λ=240 nm處吸光度變化，結果如圖4所示。

由圖4可知，在限氮條件下，出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活力隨著乙二胺四乙酸（EDTA）的濃度改變而異，添加乙二胺四乙酸（EDTA）后，酶活力有較大幅度上升。從0～0.6 g/L，乙二胺四乙酸（EDTA）和酶活力呈正比，之后隨著濃度的增加，酶活力呈下降趨勢，峰值酶活力對映的乙二胺四乙酸（EDTA）濃度為0.6 g/L。而在富氮條件下，對于出發(fā)菌株和誘變菌株，乙二胺四乙酸（EDTA）濃度為0.6 g/L時，能較大幅度提高酶活力，添加其他濃度的乙二胺四乙酸（EDTA）時，則對酶活力影響不大。

在添加乙二胺四乙酸（EDTA）的條件下，限氮培養(yǎng)比富氮培養(yǎng)更能提高出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活力。結果表明，乙二胺四乙酸（EDTA）能去除酶中重金屬雜質，從而解除重金屬離子對木質素過氧化物酶（LiP）的抑制作用。

2.3.2 抗壞血酸對酶活力的影響 在富氮和限氮培養(yǎng)基中分別添加0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的抗壞血酸，37 ℃培養(yǎng)7 d后分別測定出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活力，預熱至37 ℃，加入1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL啟動反應，測定反應最初3 min內λ=240 nm處吸光度變化，結果如圖5所示。

由圖5可知，在限氮條件下，出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活隨著抗壞血酸的濃度改變而改變。在添加0.05～0.1 g/L的抗壞血酸后，酶活力上升，當濃度大于0.1 g/L后，酶活力與濃度呈反比。而富氮條件下，對于出發(fā)菌株和誘變菌株，添加0.05～0.4 g/L的抗壞血酸后，酶活力上升，濃度為0.4 g/L時，酶活力最高。之后隨著濃度的增加，酶活力降低。

在添加抗壞血酸的條件下，限氮培養(yǎng)比富氮培養(yǎng)更能提高出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活力。

3 結論

1）經過木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）的酶學性質對比分析，表明Fe3+對木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）都有很強的抑制作用，Fe2+、Ca2+則對木質素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）表現出不同的促進作用。此外，Na+對木質素過氧化物酶（LiP）表現出一定的抑制作用，對錳過氧化物酶（MnP）作用卻不明顯，Cu2+對錳過氧化物酶（MnP）有很強的促進作用，但對木質素過氧化物酶（LiP）作用不明顯。

2）在陰離子影響酶活力方面，Br-比Cl-的激活作用稍弱。這與具體的反應機理有關，缺乏對照的試驗將很難給出客觀的數據分析。

3）在添加乙二胺四乙酸（EDTA）或抗壞血酸的條件下，限氮培養(yǎng)比富氮培養(yǎng)更能提高出發(fā)菌株和誘變菌株的酶活力。

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