吳成玲

摘要 建立了親水相互作用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析糖胺聚糖類復(fù)雜樣品的方法。在高分辨質(zhì)譜聯(lián)用條件下，流動(dòng)相5 mmol/L醋酸銨緩沖溶液可有效使用。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同的色譜柱進(jìn)行了篩選。其中，氨基親水相互作用色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分離效果不佳；酰胺基親水相互作用色譜柱僅適用于透明質(zhì)酸寡糖的分析，可以有效分離聚合度2～20的透明質(zhì)酸寡糖；在較高溫度下，兩性離子基質(zhì)的親水相互作用色譜柱可以對(duì)聚合度2～30的透明質(zhì)酸寡糖和聚合度2～12的硫酸軟骨素寡糖有效分離；而二醇基親水相互作用色譜柱對(duì)透明質(zhì)酸（聚合度2～30）、硫酸軟骨素（聚合度2～20）以及肝素（聚合度4～20）都適用，并呈現(xiàn)出較好的分離效果。本研究比較了不同類型的親水相互作用色譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜對(duì)不同聚合度、不同電荷密度的糖胺聚糖寡糖的分離特點(diǎn)，建立了相應(yīng)的高效分離和分析方法。本方法有較高的分辨率和質(zhì)譜適用性。

關(guān)鍵詞；親水相互作用色譜； 四極桿/時(shí)間飛行質(zhì)譜； 糖胺聚糖； 寡糖

1引言

糖胺聚糖是在細(xì)胞表面和細(xì)胞間基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)的呈線性的酸性多糖。糖胺聚糖通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞活動(dòng)從而參與到生理和病理學(xué)過(guò)程中，如細(xì)胞的擴(kuò)增和分化，細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用以及細(xì)胞與細(xì)胞間基質(zhì)的相互作用等[1～3]。糖胺聚糖基于它們的單糖組成以及單糖之間糖苷鍵的位置和構(gòu)象，可以大體分為4類：透明質(zhì)酸（HA），硫酸皮膚素/硫酸軟骨素（DS/CS），硫酸乙酰肝素/肝素（HS/HP）和硫酸角質(zhì)素（KS）。糖胺聚糖類與蛋白質(zhì)相互作用的特異性取決于糖胺聚糖種類、大小、糖組成、電荷密度和序列等[4，5]。相對(duì)于糖胺聚糖的其它結(jié)構(gòu)特征，SO2

Symbolm@@ 4數(shù)目多少大體排序?yàn)镠P>DS≈CS≈HS>HA [9 ]。糖胺聚糖類寡糖經(jīng)常被作為模型，用于研究糖胺聚糖結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。針對(duì)不同糖胺聚糖構(gòu)效關(guān)系研究、糖胺聚糖酶活力測(cè)定、糖胺聚糖降解程度、糖胺聚糖寡糖制備的監(jiān)控，建立有效的糖胺聚糖寡糖在線分析方法至關(guān)重要。

目前，用于分析糖胺聚糖類寡糖的方法有強(qiáng)陰離子交換（SAX）高效液相色譜（HPLC）和反相離子對(duì)（IPRP）色譜 [10～12 ]等。然而，強(qiáng)陰離子交換色譜方法呈現(xiàn)出較低的分辨率和穩(wěn)定性，同時(shí)它使用的高濃度的無(wú)機(jī)緩沖鹽溶液限制了它與質(zhì)譜的聯(lián)用，從而無(wú)法在線檢測(cè)所得寡糖的分子量、組成和序列；IPRP方法有較好的分辨率，而且所使用的揮發(fā)性離子對(duì)試劑可以用于質(zhì)譜，但是它們通常殘留在離子源和毛細(xì)管中，從而降低了質(zhì)譜的靈敏度和分辨率 [13，14 ]。

本研究針對(duì)具有不同電荷密度的糖胺聚糖寡糖，采用4種基質(zhì)的親水相互作用色譜（HILIC）方法。研究表明，與SAX和IPRP方法相比，HILIC方法有更好的質(zhì)譜兼容性； 同時(shí)，針對(duì)不同的糖胺聚糖寡糖可以選擇不同的HILIC方法。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent 1260 Infinity液相色譜儀串聯(lián)四級(jí)桿/飛行時(shí)間（Q/TOF）質(zhì)譜（6540，美國(guó)Agilent公司）。醋酸銨、硫酸軟骨素A（CSA） 和HA（美國(guó)Sigma公司）；乙腈（德國(guó)Merck公司）；軟骨素ABC酶（Chondroitinase ABC，北京艾德豪克國(guó)際技術(shù)有限公司）；低分子量肝素：依諾肝素為美國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)品（USP）。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1酶水解制備HA寡糖、CSA寡糖分別取2.0 mg HA和CSA樣品溶于400 μL酶解緩沖液（10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 6.8），將HA和CSA樣品配制成5 mg/mL溶液，分別加入軟骨素酶ABC 5 mU，置于水浴箱中37℃反應(yīng)4 h。酶解液高溫滅活然后離心，上清液備用。

2.2.2寡糖的高效液相親水相互作用色譜分析（HPLCHILIC）

流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨溶液，流動(dòng)相B為5 mmol/L醋酸銨95%乙腈溶液，紫外檢測(cè)器設(shè)置為232 nm在線檢測(cè)。氨基HILIC色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 日本COSMOSIL公司）；酰胺基HILIC色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm，北京華譜新創(chuàng)公司），柱溫30℃，流速0.5 mL/min，30 min內(nèi)流動(dòng)相B從90% 降到 35%進(jìn)行梯度洗脫；兩性離子（ZIC）HILIC色譜柱 （100 mm×2.1 mm， 5 μm，德國(guó) Merck公司），柱溫30℃/85℃，流速0.3 mL/min，25 min內(nèi)流動(dòng)相B從90% 降到 35%進(jìn)行梯度洗脫；二醇基HILIC色譜柱 （150 mm×2.0 mm， 3 μm LUNA， 加拿大Phenonenex公司），柱溫30℃，流速0.3 mL/min，25 min內(nèi)流動(dòng)相B從90% 降到 35%進(jìn)行梯度洗脫。

2.2.3寡糖的質(zhì)譜分析

氮?dú)庥米黛F化氣，霧化壓力為30 Pa。噴霧電壓為3.5 kV，氮?dú)饬魉贋? L/min，干燥過(guò)程中溫度為350℃。碎片電壓為100 V。在m/z 100～2000的范圍內(nèi)進(jìn)行全離子流掃描。所有數(shù)據(jù)都在負(fù)離子模式下進(jìn)行采集，經(jīng)Mass Hunter工作站下處理。3結(jié)果與討論

3.1氨基HILIC色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分析

在文獻(xiàn)＼[15＼]中，氨基HILIC色譜柱已被用于糖胺聚糖二糖分析＼[15＼]，但該法以高濃度不揮發(fā)性緩沖鹽作為流動(dòng)相，因此無(wú)法與質(zhì)譜聯(lián)用，而且對(duì)于寡糖的分離和分析并沒有直接的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用氨基HILIC色譜柱進(jìn)行糖胺聚糖的寡糖分析，結(jié)果表明，即使在高濃度醋酸銨緩沖鹽的條件下，寡聚糖仍然無(wú)法被完全洗脫（譜圖未顯示），而據(jù)經(jīng)驗(yàn)100 mmol/L以上的揮發(fā)性鹽已經(jīng)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)造成了影響。造成這種現(xiàn)象可能是該氨基柱中樹脂表面鍵合的氨基基團(tuán)與糖胺聚糖寡糖結(jié)合作用太強(qiáng)，

3.2酰胺基HILIC色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分離

采用酰胺基HILIC色譜柱分別對(duì)HA、CSA和HP進(jìn)行分析，結(jié)果表明，HA寡聚糖能夠得到很好的分離，如圖1所示。根據(jù)相應(yīng)質(zhì)譜結(jié)果（圖譜未顯示），色譜圖中每個(gè)峰得到了準(zhǔn)確的歸屬。其中HA寡聚糖在聚合度2～20的范圍內(nèi)能夠得到很好的分離。然而在使用此色譜柱對(duì)CSA與HP寡糖混合物進(jìn)行分離時(shí)，在合理的緩沖鹽濃度范圍內(nèi)無(wú)法有效洗脫寡糖（譜圖未顯示）。該色譜柱樹脂表面的酰胺基團(tuán)具有較弱的離子作用，能夠與含有較少負(fù)電荷的HA的寡聚糖產(chǎn)生適當(dāng)?shù)南嗷プ饔?，并能夠有效分離HA寡糖。

3.3兩性離子（ZIC）HILIC色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分析

本實(shí)驗(yàn)使用ZICHILIC色譜柱分別對(duì)3種糖胺聚糖類寡糖進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，HA寡糖在聚合度2～28的范圍內(nèi)達(dá)到較好分離，如圖2A所示，其中質(zhì)譜結(jié)果確認(rèn)了它們的聚合度（圖譜未顯示）。ZICHILIC的兩性離子基質(zhì)使得HA寡聚糖達(dá)到了更高的分辨率。然而HA的每一個(gè)寡糖都分裂成了兩個(gè)峰，這是由寡糖還原端產(chǎn)生的α和β構(gòu)型共存導(dǎo)致的（圖2A）。根據(jù)文獻(xiàn)＼[16，17＼]，增加柱溫可以減少或消除這種現(xiàn)象。因此，本實(shí)驗(yàn)中將柱溫升高到85

SymbolpB@ C，每個(gè)HA寡糖在常溫下出現(xiàn)的雙峰完全消失，同時(shí)還保留了較高的分辨率（圖2B）。此外，此色譜柱也對(duì)CSA具有較好的分辨率（圖2C）。但此色譜柱不適用于HP的分離分析。

3.4二醇基（Diol）HILIC色譜柱對(duì)糖胺聚糖類寡糖的分離

使用DiolHILIC色譜柱分別對(duì)3種寡聚糖進(jìn)行了分離。結(jié)果表明，HA寡糖在聚合度2～30范圍內(nèi)能夠得到有效分離（圖3A）；CSA寡糖在聚合度2～20范圍內(nèi)達(dá)到較好分離（圖3B）；HP寡糖在聚合度4～20范圍內(nèi)也得到了較高分辨率的分離（圖3C）。質(zhì)譜數(shù)據(jù)確定了每個(gè)相應(yīng)色譜峰的聚合度（圖譜未顯示）。在圖3可見，只有HA寡聚糖中一些低聚合度的寡糖出現(xiàn)了α、β共存導(dǎo)致的分岔現(xiàn)象。此類型色譜柱樹脂表面二醇基的弱電離作用使得具有不同分子大小和不同電荷密度的這類聚陰離子寡糖都能得到較好的分離效果。

色譜柱30℃條件下所得HA（A）， CSA（B）， 肝素（C）的分離效果譜圖。

HA oligosaccharides （A）， CSA oligosaccharides （B） and heparin（HP） oligosaccharides obtained on the diolHILIC column at 30℃. 4結(jié) 論

建立了親水相互作用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析糖胺聚糖類復(fù)雜樣品的方法。對(duì)4種具有不同基質(zhì)的HILIC色譜柱進(jìn)行了評(píng)價(jià)。對(duì)于HA寡聚糖，具有最低的電荷密度，可以使用酰胺基HILIC、ZICHILIC和DiolHILIC在5 mmol/L乙酸銨存在下用常規(guī)的正相色譜條件進(jìn)行分析。對(duì)于CSA寡糖，平均每個(gè)二糖單位中含有一個(gè)羧基和一個(gè)硫酸根，可以使用ZICHILIC和DiolHILIC色譜柱在5 mmol/L乙酸銨的存在下用常規(guī)的正相色譜條件進(jìn)行分析。而肝素寡糖只能使用DiolHILIC色譜柱在以上條件下進(jìn)行分離。以上方法均在低濃度的揮發(fā)性緩沖鹽條件下進(jìn)行，能夠與質(zhì)譜高效結(jié)合。其中，ZICHILIC需要較高的柱溫消除α、β共存，而DiolHILIC色譜柱能夠在較低溫度條件下實(shí)現(xiàn)不同大小分子及不同電荷密度的糖胺聚糖類寡糖的高效分離分析。

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AbstractA hydrophilic interaction liquid chromatography （HILIC）mass spectrometric （MS） method was developed for the analysis of glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides. By using 5 mmol/L NH4Ac as the mobile phase which was compatible with MS， four types of HILIC columns were investigated to analyze GAG oligosaccharides. The results showed that， aminoHILIC column was unsuitable for all glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides， amideHILIC column was useful only for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp20， zwitterionic phase HILIC column was useful for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp30 and to a lesser extent for chondroitin oligosaccharides from dp2 to dp12， and diolHILIC column afforded excellent resolution of hyaluronan （dp2-dp30）， chondroitin sulfate （dp2-dp20） and heparin （dp4-dp20） oligosaccharides. In conclusion， different HILIC columns were investigated and on the basis of this， GAG oligosaccharides were separated and then analyzed by HILIC MS method. The developed methods have higher resolution and better compatibility of MS.

KeywordsHydrophilic interaction liquid chromatography； Quadrupoletimeofflight mass spectrometry； Glycosaminoglycan； Oligosaccharides

（Received 21 March 2015； accepted 31 May 2015）