朱玉風(fēng)　曹贊霞　趙立嶺　王吉華（山東師范大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南5004；山東省功能大分子生物物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東德州50；德州學(xué)院生物物理研究所，山東德州50）

固有無(wú)序超嗜熱菌FlgM蛋白在兩種不同溫度下的構(gòu)象變化特征

朱玉風(fēng)1，2，3曹贊霞2，3趙立嶺2，3王吉華2，3，*
（1山東師范大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250014；2山東省功能大分子生物物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東德州253023；3德州學(xué)院生物物理研究所，山東德州253023）

基于分子動(dòng)力學(xué)模擬方法比較了超嗜熱菌FlgM蛋白在常溫（293 K）和生理溫度（358 K）下的結(jié)構(gòu)特征.基于GROMACS軟件包，采用OPLS-AA分子力場(chǎng)和TIP3P水模型，對(duì)超嗜熱菌FlgM蛋白在293和358 K進(jìn)行了2組獨(dú)立的長(zhǎng)時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬，每組體系模擬時(shí)間為1500 ns.主要分析了兩種溫度下超嗜熱菌FlgM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征、整體構(gòu)象變化及半無(wú)序化區(qū)域和結(jié)構(gòu)化區(qū)域的構(gòu)象特征.研究結(jié)果表明：在常溫下，N端具有一定程度的螺旋成分，但在生理溫度下，超嗜熱菌FlgM蛋白的結(jié)構(gòu)變得松散，螺旋結(jié)構(gòu)減少，構(gòu)象穩(wěn)定性減弱，H1螺旋散開(kāi)，F(xiàn)lgM蛋白構(gòu)象靈活性增強(qiáng)，不穩(wěn)定程度增加.這些不同溫度的結(jié)構(gòu)變化說(shuō)明：半無(wú)序化區(qū)域（N端）在非結(jié)合狀態(tài)下有一定的螺旋結(jié)構(gòu)，但該段螺旋的穩(wěn)定性隨溫度升高而降低.超嗜熱菌FlgM蛋白會(huì)通過(guò)增加結(jié)構(gòu)的無(wú)序程度使結(jié)構(gòu)更加靈活，以適應(yīng)高溫，從而使該類(lèi)固有無(wú)序蛋白更好地行使其功能，如提高同其他成分的結(jié)合速率等.

FlgM蛋白；固有無(wú)序蛋白；分子動(dòng)力學(xué)模擬；溫度適應(yīng)性；結(jié)構(gòu)特征

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1　引言

自然界億萬(wàn)年的發(fā)展進(jìn)化使細(xì)菌具有極強(qiáng)的適應(yīng)性.在溫度適應(yīng)性方面，如嗜熱菌和嗜冷菌這類(lèi)嗜極細(xì)菌能夠在極端的溫度下生存.嗜熱蛋白、嗜常溫蛋白和嗜冷蛋白1的相關(guān)研究表明，嗜冷蛋白具有高柔韌性和低耐熱性，而嗜熱蛋白能形成較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，這些都表明溫度能夠影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu). FlgM蛋白是一類(lèi)典型的溫度感應(yīng)蛋白質(zhì)，同源FlgM蛋白在不同生理溫度的細(xì)菌中廣泛存在，如在生理溫度273 K（0°C）的Leptothrix cholodnii和生理溫度358 K（85°C）的Aquifex aeolicus.FlgM蛋白作為RNA轉(zhuǎn)錄因子抑制劑，是鞭毛綜合體運(yùn)動(dòng)性和趨藥性基因的負(fù)調(diào)節(jié)器，在革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中大量存在.2-7FlgM蛋白的基因功能在物種間高度保守，但同源FlgM蛋白在序列結(jié)構(gòu)上差別很大.8

我們的前期預(yù)測(cè)研究8表明：39個(gè)物種的同源FlgM蛋白的生理溫度與其結(jié)構(gòu)無(wú)序性具有相關(guān)性.其生理溫度的變化范圍為0°C（273 K）到85°C（358 K），不同蛋白具有不同程度的序列長(zhǎng)度、序列相似性、二級(jí)結(jié)構(gòu)含量及無(wú)序程度等等.39個(gè)同源FlgM蛋白均為固有無(wú)序蛋白，而且隨著生理溫度的升高，蛋白長(zhǎng)度變短，無(wú)序區(qū)的無(wú)序程度減小.這39個(gè)同源FlgM蛋白在無(wú)序程度上相差很大，分為有序態(tài)、半無(wú)序態(tài)和全無(wú)序態(tài).其中序列較短的蛋白（長(zhǎng)度＜97個(gè)氨基酸殘基）具有高溫適應(yīng)性（溫度＞45°C 或318 K），其高溫適應(yīng)性在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為N端為半無(wú)序態(tài)且具有較高螺旋含量.8而非高溫最適生長(zhǎng)溫度的FlgM蛋白的N端含有極少二級(jí)結(jié)構(gòu)，呈全無(wú)序態(tài).這些結(jié)果表明：不同物種的FlgM蛋白通過(guò)由含有極少二級(jí)結(jié)構(gòu)的全無(wú)序態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^高螺旋含量的半無(wú)序態(tài)來(lái)適應(yīng)高溫，全無(wú)序到半無(wú)序的轉(zhuǎn)變可能是自然界生物適應(yīng)高溫的策略.

超嗜熱菌（the thermophile Aquifex aeolicus，A. aeolicus）可適應(yīng)85-95°C的高溫.其FlgM（簡(jiǎn)寫(xiě)A.a. FlgM）蛋白是固有無(wú)序蛋白質(zhì)，9同時(shí)具有半無(wú)序特征.10固有無(wú)序蛋白的無(wú)序特征有利于其同其他成分發(fā)生相互作用.11，12圓二色譜（CD）實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，13A.a.FlgM蛋白在室溫20°C（293 K）下稀溶液和粘性溶液中都表現(xiàn)出明顯的α螺旋結(jié)構(gòu)（A.a.FlgM蛋白在室溫下具有活性），形成α螺旋的百分含量高達(dá)40.5%；隨著溫度升高直至生理溫度85°C（358 K）時(shí)，α螺旋特性逐漸減弱.CD實(shí)驗(yàn)證明A.a.FlgM蛋白柔性結(jié)構(gòu)與溫度明顯相關(guān).

但是，這個(gè)半無(wú)序蛋白在原子水平的構(gòu)象如何隨著溫度發(fā)生變化？該蛋白半無(wú)序區(qū)的構(gòu)象集合特征如何？半無(wú)序區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū)的變化有何不同？這些變化與其高溫適應(yīng)性調(diào)節(jié)有何關(guān)聯(lián)？這一系列問(wèn)題都有待解決.到目前為止，已經(jīng)有針對(duì)A.a.FlgM蛋白的實(shí)驗(yàn)方面的結(jié)構(gòu)研究，13，14但并沒(méi)有揭示溫度是如何影響A.a.FlgM蛋白的結(jié)構(gòu)特征的.分子動(dòng)力學(xué)模擬15-18作為一種有效工具，能將蛋白結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)變化可視化和量化，能夠清楚地得出蛋白結(jié)構(gòu)及其變化.

本文使用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法研究A.a. FlgM蛋白在不同溫度下的結(jié)構(gòu)特征，比較不同溫度對(duì)半無(wú)序蛋白A.a.FlgM構(gòu)象變化的影響.為了與實(shí)驗(yàn)信息相比較，分子動(dòng)力學(xué)模擬選擇293 K（20°C）和358 K（85°C）兩個(gè)溫度.分析了兩個(gè)溫度下的主鏈二面角、二級(jí)結(jié)構(gòu)、代表性構(gòu)象、回旋半徑、均方根漲落（RMSF）等參數(shù).

2　材料和方法

2.1超嗜熱菌FlgM（A.a.FlgM）蛋白的結(jié)構(gòu)

A.a.FlgM蛋白的序列14為：1MVNRIELSRLI GLLLETEKRKNEQKESGTNKIEDKVTLSKIAQEL SKNDVEEKDLEKKVKELKEKIEKGEYEVSDEKV VKGLIEFFT88，共88個(gè)殘基.2004年14首次測(cè)定了A.a.FlgM蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，使用X射線晶體衍射（分辨率：0.325 nm和0.23 nm）得到超嗜熱菌σ28/FlgM復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1SC5），該結(jié)構(gòu)中沒(méi)有1-2號(hào)和18-31號(hào)殘基信息.使用Discovery Studio建模軟件，在晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上將18-31號(hào)缺失殘基補(bǔ)齊，殘基序列為：3NRIELSRLIGLLLETEKRKNTEQ KESGTNKIEDKVTLSKIAQELSKNDVEEKDLEKK VKELKEKIEKGEYEVSDEKVVKGLIEFFT88，共86個(gè)殘基.我們以此結(jié)構(gòu)（圖1）作為本文模擬研究的初始結(jié)構(gòu).該結(jié)構(gòu)有四段螺旋：2-14、35-46、56-67及74-83片段，依次為H1、H2、H3、H4螺旋（86個(gè)殘基，序號(hào)從1開(kāi)始）.

2.2分子動(dòng)力學(xué)模擬和體系準(zhǔn)備

基于GROMACS軟件（版本4.5.3），19采用OPLSAA力場(chǎng)20及TIP3P水模型，21研究A.a.FlgM蛋白.初始構(gòu)象見(jiàn)2.1節(jié)，采用NPT系綜，將蛋白溶解在周期性截?cái)喟嗣骟w盒子里，蛋白到盒子的最小距離設(shè)定為1.0 nm.帶電基團(tuán)選擇在中性pH下的質(zhì)子化狀態(tài).添加的水分子為13495個(gè)，加入了2個(gè)Na+離子替換2個(gè)水分子使pH保持電中性.首先使用最陡下降法方法進(jìn)行第一次能量?jī)?yōu)化，然后使用共軛梯度法進(jìn)行第二次能量?jī)?yōu)化.本模擬采用particle-mesh Ewald（PME）方法22，23處理長(zhǎng)程靜電相互作用，采用cut-off方法處理范德華相互作用，采用長(zhǎng)度為0.12 nm的網(wǎng)格，溫度耦合采用V-rescale算法，24壓強(qiáng)耦合采用Berendsen算法，25每10步更新一次鄰居列表.模擬溫度設(shè)定為293 K（20°C）和358 K（85°C）兩個(gè)溫度，對(duì)得到的體系進(jìn)行約束分子動(dòng)力學(xué)模擬.對(duì)293 K的模擬，采用六步升溫，設(shè)定為50、100、150、200、250、293 K.對(duì)358 K的模擬，采用七步升溫，設(shè)定為50、100、150、200、250、293、358 K.隨后在兩個(gè)不同溫度下分別進(jìn)行1500 ns的自由動(dòng)力學(xué)模擬.最后，取各自最后200 ns的坐標(biāo)軌跡進(jìn)行后續(xù)分析.通過(guò)計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)、殘基漲落、聚類(lèi)分析、快照分析、回旋半徑等等，分析了溫度對(duì)半無(wú)序蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)松散程度、構(gòu)象變化的影響.

圖1　A.a.FlgM蛋白分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)Fig.1　Initiating structure ofA.a.FlgM protein on molecular dynamics simulations

3　結(jié)果與討論

3.1A.a.FlgM蛋白具有鮮明的固有半無(wú)序態(tài)蛋白特征

我們的早期研究8基于SPINE-D10，26和SPINEX27，28對(duì)A.a.FlgM蛋白進(jìn)行無(wú)序程度和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè).SPINE-D是基于序列集成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)無(wú)序預(yù)測(cè)程序，預(yù)測(cè)結(jié)果以無(wú)序程度P取值從0到1呈現(xiàn)（0和1分別對(duì)應(yīng)完全有序態(tài)和完全無(wú)序態(tài)），能夠很好地計(jì)算和區(qū)分全無(wú)序區(qū)與半無(wú)序區(qū).在該預(yù)測(cè)結(jié)果中，A.a.FlgM蛋白有兩段半無(wú)序區(qū)：2-64及78-88片段，一段有序區(qū)：65-77片段；有四段螺旋結(jié)構(gòu)：3-15、33-47、58-65及76-87片段.預(yù)測(cè)結(jié)果表明A.a.FlgM蛋白屬于固有半無(wú)序蛋白，其N(xiāo)端部分屬于半無(wú)序區(qū)，而C端部分屬于結(jié)構(gòu)化區(qū)域.

3.2不同溫度下A.a.FlgM蛋白的總體構(gòu)象變化情況

為了探討溫度對(duì)A.a.FlgM蛋白總體構(gòu)象的影響，我們分析了構(gòu)象snapshot和殘基漲落.Snapshot可以從一系列蛋白質(zhì)構(gòu)象中得到一組具有代表性的構(gòu)象，縮減了構(gòu)象數(shù)據(jù)，方便進(jìn)行總體構(gòu)象分析.在1500 ns的軌跡中，每100 ns軌跡聚類(lèi)得到一個(gè)代表性構(gòu)象（聚類(lèi)是基于構(gòu)象相互之間的Cα原子的均方根偏差進(jìn)行分析的，cutoff設(shè)為0.1），共聚類(lèi)15次，得到15個(gè)代表性構(gòu)象，如圖2所示.為了更加明顯地呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)變化，另外使用了STRIDE程序29，30計(jì)算了二級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間的變化來(lái)分析蛋白質(zhì)在不同溫度下的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況，31，32如圖3所示.初始構(gòu)象含有四段螺旋結(jié)構(gòu)，隨著模擬時(shí)間的增長(zhǎng)，C端的兩個(gè)螺旋H3和H4在兩個(gè)溫度下都解開(kāi).在293 K下，H1和H2螺旋基本保持穩(wěn)定，與在復(fù)合物中的結(jié)構(gòu)基本相同；但在358 K下，H2螺旋基本保持不變，H1螺旋慢慢解開(kāi)，并且有向折疊片轉(zhuǎn)變的趨勢(shì).

另一方面，我們分析了構(gòu)象總體的穩(wěn)定性，計(jì)算了兩個(gè)不同溫度下最后200 ns即1301-1500 ns的殘基漲落情況，如圖4所示.殘基的均方根漲落反映了構(gòu)象系綜中原子的漲落情況，RMSF越大表示分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中殘基偏離參考構(gòu)象的程度越大.在圖4中，1-20號(hào)殘基、25-32號(hào)殘基、49-86號(hào)殘基漲落明顯增加，即H1、H3和H4螺旋穩(wěn)定性較差. 在RMSF概率分布中，變化最明顯的是0-0.2和0.2-0.6區(qū)間內(nèi)，溫度升高，RMSF在0-0.2之間的概率明顯減少，RMSF在0.2-0.6之間的概率明顯增加.溫度升高之后殘基漲落整體增加，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差，但是358 K左右是超嗜熱菌的生理溫度，說(shuō)明FlgM蛋白功能的實(shí)現(xiàn)需要一定的無(wú)序程度.

圖2　293和358 K溫度下在0-1500 ns內(nèi)從snapshot取出的連續(xù)構(gòu)象Fig.2　Sequential conformations from snapshot during 0-1500 ns at temperatures of 293 and 358 K（a）293 K，（b）358 K.（1）-（15）indicate the most clustered structure of selected group.Conformations are represented as cartoon in the same proportion.The four helixes colored with green，yellow，blue，and red，respectively.

圖3　293和358 K溫度下在0-1500 ns內(nèi)各構(gòu)象二級(jí)結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化Fig.3　The second structure content plotted as a function of time of each conformation during 0-1500 ns at temperatures of 293 and 358 K（a）293 K；（b）358 K.The structures of H，G，I，B，b，E，T，C are colored of blueviolet，black，yellow，blue，cyan，red，green，and white，respectively. H：Alpha helix；G：3-10 helix；I：PI-helix；E：extended conformation；B or b：Isolated bridge；T：Turn；C：Coil（none of the above）

3.3在不同溫度下A.a.FlgM蛋白的聚類(lèi)分析

前面分析發(fā)現(xiàn)蛋白在358 K下穩(wěn)定性減弱.根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，A.a.FlgM蛋白的N端部分屬于半無(wú)序化區(qū)域，而C端部分屬于結(jié)構(gòu)化區(qū)域.為了分析溫度對(duì)半無(wú)序化區(qū)域和結(jié)構(gòu)化區(qū)域是否存在不同影響，我們選取了N端的1-38號(hào)殘基片段和C端的47-84號(hào)殘基片段各38個(gè)殘基作為研究對(duì)象，進(jìn)行聚類(lèi)分析.聚類(lèi)使用g_cluster程序，基于構(gòu)象相互之間的Cα原子的均方根偏差進(jìn)行分析，cutoff設(shè)為0.1，結(jié)果如表1所示.從表1可以看出，無(wú)論是半無(wú)序化區(qū)域還是結(jié)構(gòu)化區(qū)域，358 K下聚類(lèi)數(shù)都要比293 K下多，表明358 K下的構(gòu)象類(lèi)型較多，構(gòu)象采樣更豐富；同時(shí)說(shuō)明相同時(shí)間內(nèi)，采樣構(gòu)象數(shù)多，即構(gòu)象變化范圍更廣闊.在生理溫度下，A.a.FlgM蛋白的靈活性增大，有利于它同其它成分相互作用，進(jìn)而行使其生物功能.

3.4在不同溫度下A.a.FlgM蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

前面是基于整體分析溫度對(duì)構(gòu)象的影響.下面基于二面角分布和二級(jí)結(jié)構(gòu)形成情況，分析溫度對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響.

首先，使用g_rama程序計(jì)算1301-1500 ns內(nèi)殘基主鏈二面角進(jìn)而得到其分布，使用平均力勢(shì)（PMF）分布來(lái)表征.二面角平均力勢(shì)PMF定義為：

其中R為理想氣體常數(shù)，T為溫度，Pi為殘基主鏈二面角落入?yún)^(qū)域i的幾率.區(qū)域i為-180°≤ψ≤180° 且-180°≤φ≤180°范圍內(nèi)的小區(qū)間.兩模擬體系的殘基主鏈二面角平均力勢(shì)分布如圖5所示.平均力勢(shì)越低，相應(yīng)構(gòu)象被采樣的幾率就越大，圖中紅色區(qū)域?yàn)槠骄?shì)極小區(qū)域，相鄰力勢(shì)曲線間隔為2 kJ·mol-1.由圖5可知，在293 K下半無(wú)序區(qū)域的主鏈二面角主要分布在α螺旋區(qū)域，其他區(qū)域較少；結(jié)構(gòu)化區(qū)域的主鏈二面角主要分布在β折疊區(qū)域.在358 K下，半無(wú)序區(qū)域的主鏈二面角平均分布在β折疊區(qū)域和α螺旋區(qū)域；結(jié)構(gòu)化區(qū)域的主鏈二面角主要分布在β折疊區(qū)域.能量低點(diǎn)說(shuō)明相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的可能性較大，但不一定形成.表2給出了不同溫度下不同片段落在α螺旋區(qū)域和β折疊區(qū)域的平均力勢(shì)極小值的相對(duì)深度及坐標(biāo).結(jié)果表明，對(duì)半無(wú)序化片段，溫度升高后其在α螺旋區(qū)域的采樣明顯減少，β折疊區(qū)域的采樣明顯增加；而對(duì)結(jié)構(gòu)化區(qū)域，溫度升高后其在α螺旋區(qū)域的采樣和β折疊區(qū)域的采樣無(wú)明顯變化.有實(shí)驗(yàn)13發(fā)現(xiàn)，在0 mol·L-1葡萄糖濃度下，293 K下形成31%的α螺旋結(jié)構(gòu)和11%的β折疊結(jié)構(gòu)，358 K下形成24%的α螺旋結(jié)構(gòu)和21% 的β折疊結(jié)構(gòu)，這就意味著溫度升高后α螺旋結(jié)構(gòu)成分減少，β折疊結(jié)構(gòu)成分增加，我們的模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相符合的.

圖4　293和358 K溫度下在1301-1500 ns內(nèi)各殘基的均方根漲落分布（RMSF）Fig.4　Root mean square fluctuation（RMSF）of each residue during 1301-1500 ns at temperatures of 293 and 358 K

表1　293和358 K下1301-1500 ns構(gòu)象聚類(lèi)分布Table 1　Clustered conformation distribution during 1301-1500 ns at temperatures of 293 and 358 K

同時(shí)，使用STRIDE軟件29，30分別計(jì)算1301-1500 ns時(shí)間內(nèi)的殘基形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況.結(jié)果表明，293 K下，螺旋（包括α螺旋和3-10螺旋）結(jié)構(gòu)所占的比例為18.8%，β折疊片結(jié)構(gòu)所占的比例為0.8%，Turn結(jié)構(gòu)所占的比例為45.7%，無(wú)規(guī)卷曲（Coil）結(jié)構(gòu)所占的比例為31.2%.358 K下，螺旋（包括α螺旋和3-10螺旋）結(jié)構(gòu)所占的比例為12.9%，β折疊片結(jié)構(gòu)所占的比例為13.8%，Turn結(jié)構(gòu)所占的比例為48.0%，Coil結(jié)構(gòu)所占的比例為24.4%.說(shuō)明隨著溫度增加α螺旋含量減少，而β折疊結(jié)構(gòu)增加.

圖5　293和358 K溫度下半無(wú)序化區(qū)域和結(jié)構(gòu)化區(qū)域中殘基主鏈Ramachandran二面角（φ，ψ）對(duì)應(yīng)的平均力勢(shì)（PMF）分布Fig.5　Distributions of potentials of mean force（PMF）plotted as a function of the Ramachandran angles（φ，ψ）of residue backbones for semi-disordered region and structured region respectively at the temperatures of 293 and 358 K（a）semi-disordred region at the temperature of 293 K；（b）structured region at the temperature of 293 K；（c）semi-disordered region at the temperature of 358 K；（d）structured region at the temperature of 358 K.Neighboring contour lines are separated by 2 kJ·mol-1.

表2　A.a.FlgM蛋白殘基主鏈二面角（φ，ψ）PMF極小值分布及相應(yīng)坐標(biāo)Table 2　Distributions of the PMF minima of Ramachandran angle（φ，ψ）of residue backbones ofA.a.FlgM protein and corresponding coordinates

為進(jìn)一步分析比較293和358 K下形成螺旋結(jié)構(gòu)的差異，計(jì)算了各殘基形成螺旋結(jié)構(gòu)或折疊結(jié)構(gòu)的概率，如圖6所示.在293 K下，形成兩段螺旋：2-14段殘基，形成概率介于17.6%-99.0%；35-45段殘基，形成概率介于17.6%-99.0%.在358 K下，同樣形成兩段螺旋：2-8段殘基，形成概率介于14.5%-66.0%；37-45段殘基，形成概率介于63.9%-99.4%.在兩個(gè)不同溫度下，第二段螺旋沒(méi)有明顯變化，第一段螺旋形成概率明顯減小.初始結(jié)構(gòu)具有4段螺旋，在兩種溫度下，H3和H4都已經(jīng)消失，與圖2結(jié)果一致，表明在這部分區(qū)域即C端區(qū)域只有與核苷酸聚合酶σ因子結(jié)合時(shí)才形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而在單體情況下呈無(wú)序狀，與SPINE-D預(yù)測(cè)結(jié)果一致.螺旋H2在兩種溫度下變化不大，表明該部分區(qū)域穩(wěn)定性較強(qiáng)；H1在生理溫度（358 K）時(shí)穩(wěn)定性較差.上述分析表明，A.a.FlgM蛋白為適應(yīng)溫度變化，可能主要通過(guò)N端無(wú)序化區(qū)域的螺旋形成概率或者無(wú)序程度的變化來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)的.其他同源FlgM蛋白是否也具有類(lèi)似的溫度適應(yīng)性規(guī)律，有待于進(jìn)一步研究.

3.5在不同溫度下A.a.FlgM蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

以上分析已經(jīng)證明了溫度對(duì)A.a.FlgM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)形成具有影響，為了更準(zhǔn)確地分析構(gòu)象穩(wěn)定性的變化，使用參數(shù)Contact進(jìn)行了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析.Contact是三維蛋白質(zhì)分子中所有氨基酸殘基Cα原子之間距離的反映.定義距離閾值為0.8 nm，33即若兩殘基Cα原子之間距離小于0.8 nm，則認(rèn)為它們之間存在Contact.計(jì)算兩溫度下1301-1500 ns內(nèi)的Contact分布，如圖7所示.Percent為殘基間形成Contact的概率.圖中顏色越深，表示形成Contact的概率越大.圖中293 K下，在1-40號(hào)殘基片段之間有“U”型結(jié)構(gòu)，說(shuō)明在20號(hào)殘基附近形成彎曲；在65-80號(hào)殘基片段附近也有部分彎曲.在358 K下，在20-30、45-60、65-85號(hào)殘基片段附近有部分“U”型結(jié)構(gòu).20-30、45-60號(hào)殘基片段附近有明顯彎曲形成，結(jié)構(gòu)變化較大.在358 K還有一部分Contact形成，零散分布，結(jié)合作用較弱.由此可以得出溫度升高使得A.a.FlgM蛋白的構(gòu)象更加卷曲，構(gòu)象穩(wěn)定性減弱.

圖6　293和358 K下A.a.FlgM蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的螺旋結(jié)構(gòu)（a）和折疊結(jié)構(gòu)（b）分布Fig.6　Residue-specific second structure helix（a）and strand（b）percentages ofA.a.FlgM protein respectively at the temperatures of 293 and 358 K

圖7　293和358 K下1301-1500 ns模擬內(nèi)各殘基間contact形成情況Fig.7　Formation of contacts between residues at the temperatures of 293 and 358 K during the 1301-1500 ns simulation（a）293 K；（b）358 K.Percent is representing the formation rates of contact between residues.

圖8　293和358 K溫度下A.a.FlgM蛋白半無(wú)序化區(qū)域和結(jié)構(gòu)化區(qū)域在1301-1500 ns模擬內(nèi)回旋半徑（Rg）分布Fig.8　Distributions of radius of gyration（Rg）plotted as a function of time at the semi-disordered region and structured region fromA.a.FlgM protein at the temperatures of 293 and 358 K during the 1301-1500 ns simulation（a）semi-disordered region，（b）structured region

3.6在不同溫度下A.a.FlgM蛋白半無(wú)序化區(qū)域和結(jié)構(gòu)化區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征

蛋白回旋半徑反映了蛋白的松散程度.我們選取了N端的1-38號(hào)殘基片段和C端的47-84號(hào)殘基片段各38個(gè)殘基作為研究對(duì)象，分析不同無(wú)序程度區(qū)域的回旋半徑受溫度的影響（見(jiàn)圖8）.對(duì)于N端半無(wú)序化區(qū)域而言，其回旋半徑受溫度影響較小，358 K下略大于293 K下的變化.而對(duì)于C端結(jié)構(gòu)化區(qū)域，其回旋半徑受溫度影響比較大.同時(shí)，對(duì)N端半無(wú)序化區(qū)域和C端結(jié)構(gòu)化區(qū)域進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，C端結(jié)構(gòu)區(qū)域的伸展范圍在生理溫度下更廣，有利于它同其他成分相互作用.由此可以看出，半無(wú)序蛋白A.a.FlgM蛋白的N端半無(wú)序化區(qū)域的伸展程度隨溫度變化較小，而且高溫的伸展程度與低溫的不相上下，C端的結(jié)構(gòu)化區(qū)域的伸展程度隨溫度的變化較大，且高溫時(shí)的伸展程度明顯大于低溫的情況.這給我們以啟迪，是否可以通過(guò)溫度影響伸展效應(yīng)來(lái)區(qū)分有序化區(qū)域和無(wú)序化區(qū)域？值得進(jìn)一步研究.

4　結(jié)論

A.a.FlgM蛋白是超嗜熱菌鞭毛組裝的負(fù)反饋階段的關(guān)鍵蛋白，而高溫影響A.a.FlgM蛋白結(jié)構(gòu)這一關(guān)鍵對(duì)其功能的實(shí)現(xiàn)至關(guān)重要，實(shí)驗(yàn)表明溫度升高會(huì)導(dǎo)致A.a.FlgM蛋白構(gòu)象擴(kuò)展.為了深入探索溫度對(duì)A.a.FlgM蛋白構(gòu)象影響的微觀過(guò)程，本文模擬研究了A.a.FlgM蛋白在293和358 K下的動(dòng)力學(xué)特征.采用OPLS-AA力場(chǎng)以及TIP3P水模型，完成了兩個(gè)1500 ns的獨(dú)立長(zhǎng)時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬，總模擬時(shí)間長(zhǎng)達(dá)3000 ns.針對(duì)模擬軌跡，計(jì)算了殘基主鏈二面角、二級(jí)結(jié)構(gòu)、回旋半徑、RMSF等參數(shù)，分析了半無(wú)序化區(qū)域及結(jié)構(gòu)化區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征等.分析結(jié)果表明，在生理溫度下，H1螺旋散開(kāi)，A.a.FlgM蛋白構(gòu)象靈活性增加，不穩(wěn)定程度增加，結(jié)構(gòu)松散性增加；半無(wú)序區(qū)在非結(jié)合狀態(tài)下有一定的螺旋結(jié)構(gòu)，并且該段螺旋的穩(wěn)定性隨溫度升高而降低，同時(shí)溫度升高會(huì)使得蛋白C端結(jié)構(gòu)區(qū)的伸展范圍更廣.處于結(jié)構(gòu)化區(qū)域的C端是A.a.FlgM蛋白的功能化區(qū)域，溫度升高提高了A.a.FlgM蛋白的靈活性，有利于它同其他成分或蛋白發(fā)生相互作用.這些研究，有助于我們認(rèn)識(shí)固有無(wú)序蛋白質(zhì)的溫度效應(yīng)，為揭示有序和無(wú)序的區(qū)別提供了新的啟迪.

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Conformational Change Characteristics in the lntrinsically Disordered FlgM Protein from a Hyperthermophile at Two Different Temperatures

ZHU Yu-Feng1，2，3CAO Zan-Xia2，3ZHAO Li-Ling2，3WANG Ji-Hua2，3，*
（1Department of Physics and Electronic Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，P.R.China；2Shandong Province Key Laboratory of Biophysics for Functional Macromolecules，Dezhou 253023，Shandong Province，P.R.China；3Institute of Biophysics，Dezhou University，Dezhou 253023，Shandong Province，P.R.China）

The aim of this work was to compare the structural characteristics of the FlgM protein from the thermophile aquifex aeolicus at room temperature（293 K）and at the physiological temperature（358 K）using molecular dynamics simulations.Two independent long-time molecular dynamics simulations were performed using the GROMACS software package at 293 and 358 K，respectively.The OPLS-AAforce field and the TIP3P water model were used.Each simulation was run for 1500 ns.We mainly analyzed the secondary structural characteristics，the overall conformation variation，the conformational characteristics of a semi-disordered region and the structured region of the FlgM protein at two different temperatures.The results indicate that the helix structure of the N terminal increased at room temperature.The FlgM protein had the following characteristics at the physiological temperature：the structure loosed，the helix structure reduced in size，the conformational stability weakened，the H1 helix spread，the conformational flexibility increased，and the degree of instability increased.In summary，the semi-disordered region（N terminal）formed a helical structure in the unbound state and its stability decreased with an increase in temperature.The FlgM protein adapts to temperature by increasing the degree of disorder，creating a more flexible structure by improving the binding rate.

September 15，2014；Revised：December 16，2014；Published on Web：December 16，2014.?

.Email：jhw25336@126.com；Tel：+86-534-8985933.

FlgM protein；Intrinsically disordered protein；Molecular dynamics simulation；Temperature adapting；Structure characteristic

?Editorial office ofActa Physico-Chimica Sinica

O643；O641

10.3866/PKU.WHXB201412161

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China（61271378，31000324）.

國(guó)家自然科學(xué)基金（61271378，31000324）資助項(xiàng)目