李美曄，姜兆順，曲　衛(wèi)，趙寶昌

臨床醫(yī)學(xué)

山東漢族TIM-1基因多態(tài)性與2型糖尿病腎臟病的相關(guān)性

李美曄，姜兆順，曲衛(wèi)，趙寶昌＊

［摘要］目的探討T細(xì)胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白-1（TIM-1）基因多態(tài)性與山東漢族2型糖尿病腎病的相關(guān)性。方法采用病例-對(duì)照的方法，收集2型糖尿病腎病患者112例，正常對(duì)照組201例。采用改良的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）檢測(cè)TIM-1基因的兩個(gè)SNP位點(diǎn)：rs1039438和rs6878732，計(jì)算其基因型頻率及等位基因頻率并統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果rs1039438位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在對(duì)照組和2型糖尿病腎病組中有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P值分別為0.005和0.002），rs6878732位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論TIM-1基因與山東漢族人群2型糖尿病腎病的發(fā)病有明顯相關(guān)性，rs1039438位點(diǎn)的G等位基因可以增加2型糖尿病腎病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而此位點(diǎn)的A等位基因則為保護(hù)因素。

［關(guān)鍵詞］T細(xì)胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白-1；糖尿病腎??；基因多態(tài)性；病例-對(duì)照研究；改良型PCRRFLP

近幾十年來(lái)，隨著我國(guó)糖尿病的發(fā)病率逐步升高，糖尿病的慢性并發(fā)癥也逐漸成為危害人類健康的重要病因。其中，糖尿病腎臟病（Diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的常見原因。DKD的發(fā)病機(jī)制截至目前尚未完全明確，可能與高血糖導(dǎo)致的代謝紊亂、腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變及遺傳易感性等多種因素有關(guān)［1］。近年來(lái)研究表明，DKD的發(fā)病與T淋巴細(xì)胞的激活及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)［2］。T淋巴細(xì)胞的激活取決于Th1/Th2細(xì)胞的平衡狀態(tài)，而T細(xì)胞免疫球蛋白域和黏蛋白域蛋白-1（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein，TIM-1）選擇性表達(dá)于激活的CD4+T細(xì)胞表面，并持續(xù)地優(yōu)先表達(dá)于Th2細(xì)胞［3］。人類TIM-1基因的啟動(dòng)子區(qū)與編碼區(qū)存在多態(tài)性變換，其基因多態(tài)性可能與包括過敏性鼻炎、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種疾病存在相關(guān)性［4］。但目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道TIM-1基因多態(tài)性是否與DKD相關(guān)，為此，筆者應(yīng)用改良型聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)，檢測(cè)了山東漢族人群2型糖尿病DKD患者的TIM-1基因rs1039438和rs6878732兩個(gè)SNP位點(diǎn)，探討基因型與疾病之間的聯(lián)系，為了解糖尿病腎病的遺傳易感性及發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　研究對(duì)象

1.1DKD組2014年5月—2015年4月，于筆者所在醫(yī)院住院并診斷為DKD的患者112例。男58例，女54例；年齡（59.61±10.18）歲；平均病程（8.9±4.1）年。均符合2014年《糖尿病腎病防治專家共識(shí)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分型標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)知情同意后納入研究。

1.2正常對(duì)照（NC）組選取同期于筆者所在醫(yī)院查體中心健康體檢者201例。男107例，女94例；年齡（54.52±12.07）歲。排除了糖尿病、高血壓和腎原發(fā)性及繼發(fā)性相關(guān)疾病。以上全部研究對(duì)象均為山東漢族人群。

2　研究方法

2.1引物設(shè)計(jì)與合成在Hapmap網(wǎng)站，選取TIM-1基因的兩個(gè)tag SNP：rs1039438和rs6878732。根據(jù)SNP位點(diǎn)編號(hào)，在Ensemble網(wǎng)站查找相關(guān)序列。然后用Primer Premier5軟件設(shè)計(jì)引物如下：①用于特異性擴(kuò)增rs1039438多態(tài)位點(diǎn)的上游引物為：5'-TTGCCCAATGTCAGCCTTGGTAATGATTTACA ACCCTTAA-3'，在此上游引物的倒數(shù)第三位堿基由A突變?yōu)門，引入AflⅡ酶切位點(diǎn)，下游引物為：5'-GGGGAATGTAGCCCTATGCTGGAGAA-3'。②用于特異性擴(kuò)增rs6878732多態(tài)位點(diǎn)的上游引物為：5'-AAGATTCTGTCTCTATCTAAATAA-3'，下游引物為：5'-TATTCCAGGAGGTGATGATCTCTTGTGA TAGGCACCAGGAG-3'，在此下游引物的倒數(shù)第三位堿基由A錯(cuò)配為G，引入HinfⅠ酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物由上海生工生物工程公司合成。

2.2外周血基因組DNA的提取常規(guī)抽取靜脈血，取100 μl全血經(jīng)大連寶生物工程有限公司（Takara）的“Blood Genome DNA Extracction Kit”試劑盒提取基因組DNA。

2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán) （94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s），72℃反應(yīng)10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl及適量Marker，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察片段大小是否為靶片段。

2.4限制性內(nèi)切酶酶切取rs1039438和rs6878732 的PCR產(chǎn)物各10μl，分別加入限制性內(nèi)切酶AflⅡ和HinfⅠ各2 U，10×buffer 2μl，以滅菌水補(bǔ)足反應(yīng)體積至20μl，于37℃孵育3h。終止反應(yīng)后，各取酶切產(chǎn)物10 μl及適量Marker經(jīng)2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后在紫外燈下觀察、攝像，記錄并計(jì)數(shù)基因型。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 17.0軟件包分析處理數(shù)據(jù)。直接計(jì)算兩個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率，用Hardy-weinberg平衡公式檢驗(yàn)群體代表性。以±s表示計(jì)量資料，用方差分析比較組間差異。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)　果

3.1TIM-1基因SNP位點(diǎn)基因型分析

3.1.1TIM-1基因rs1039438 SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為193 bp，酶切產(chǎn)物獲得三種基因型：①純合子AA基因型，僅有193 bp 1個(gè)片段；②純合子GG基因型：有153 bp+40 bp 2個(gè)片段；③雜合子GA基因型，有193 bp+153 bp+40 bp 3個(gè)產(chǎn)物片段。見圖1。

1泳道為Marker，2～10泳道為樣品的檢測(cè)結(jié)果圖1　rs1039438 SNP位點(diǎn)AflⅡ酶切后電泳結(jié)果

3.1.2TIM-1基因rs6878732 SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為152 bp，酶切產(chǎn)物獲得三種基因型：①純合子TT基因型，僅有152 bp 1個(gè)片段；②純合子AA基因型，有153 bp+40 bp 2個(gè)片段；③雜合子TA基因型，有193 bp+153 bp+40 bp 3個(gè)片段。見圖2。

1泳道為Marker，2～7泳道為樣品的檢測(cè)結(jié)果圖2　rs6878732 SNP位點(diǎn)HinfⅠ酶切后電泳結(jié)果

3.2DKD組和正常對(duì)照組多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩組人群基因型分布符合Hardy-weinberg平衡，具有群體代表性 （表1）。rs1039438位點(diǎn)的三種基因型GG、GA、AA在對(duì)照組的頻率分別為0.691、0.284、0.061，在DKD組中的頻率分別為0.857、0.125、0.056，兩組間比較，P值為0.005，提示其基因型頻率在兩組間存在顯著性差異。其中，等位基因G在DKD組頻率顯著高于對(duì)照組頻率（0.919 vs 0.832，P=0.002），提示該等位基因可能為DKD的易感等位基因。等位基因A在DKD中頻率顯著低于對(duì)照組頻率（0.081 vs 0.168，P=0.002），提示等位基因A可能為DKD發(fā)生的保護(hù)因素。rs6878732位點(diǎn)的基因型頻率與等位基因頻率在兩組間均無(wú)顯著性差異。

表1　TIM-1基因型和等位基因DKD組與對(duì)照組頻率分布

4　討論

DKD是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎衰竭的常見原因。其病理改變包括腎肥大、腎小球與腎小管基底膜增厚及腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行性積聚。雖然傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為DKD為非免疫系統(tǒng)疾病，但越來(lái)越多的研究表明，固有免疫系統(tǒng)的激活和炎癥機(jī)制在DKD的致病機(jī)制中起重要作用［5，6］。

T淋巴細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞通過調(diào)節(jié)自身或其他免疫細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子既可以導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷參與胰島素抵抗，也可通過各種途徑造成腎組織損傷和纖維化，導(dǎo)致DKD的發(fā)生。戴勇等［2］利用流式細(xì)胞法分析對(duì)慢性腎功能不全患者外周血進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照相比，患者體內(nèi)Th1/Th2比值明顯下降，因此，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常可能在DKD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。區(qū)分Th1和Th2細(xì)胞亞群的重要標(biāo)志之一是CD4+T細(xì)胞上TIM-1基因的選擇性表達(dá)，CD4+T細(xì)胞被抗原激活后，細(xì)胞表面開始表達(dá)TIM-1基因并向Th2細(xì)胞偏移，Th1/Th2失衡可引起多種免疫性疾病。Shirzade等［7］在伊朗人群中，通過對(duì)300例哮喘緩和和309例正常對(duì)照的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，TIM-1基因與伊朗人群的哮喘發(fā)生有相關(guān)性。Kim等［8］發(fā)現(xiàn)TIM-1的一個(gè)6氨基酸的插入多態(tài)（157insMTTTVP）與人類的嚴(yán)重性甲型肝炎感染有關(guān)。

TIM-1基因是人類TIM基因家族第一個(gè)被識(shí)別的成員，在肝和腎中有不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本，但是編碼相同的蛋白質(zhì)。在TIM-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域和基因編碼區(qū)都發(fā)現(xiàn)了一些與疾病相關(guān)SNP位點(diǎn)，有些SNP位點(diǎn)是功能性的，而有一些則僅作為疾病的遺傳標(biāo)記。本研究得出的結(jié)論提示，TIM-1基因多態(tài)性中的不同等位基因或與DKD的易感性相關(guān)。但是由于病例尚少，所以需要收集更大的樣本，同時(shí)，需要從TIM-1的功能出發(fā)，去闡明TIM-1基因在DKD的發(fā)生中起何種作用。

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［2015-05-18收稿，2015-06-15修回］［本文編輯：王軍紅］

［中圖分類號(hào)］R587.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［作者單位］250031山東濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科（李美曄，姜兆順，曲衛(wèi)）；271016山東泰安，泰山醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室（趙寶昌）

［通訊作者］趙寶昌，Email：306519893@qq.com

AssociationbetweenTIM-1genepolymorphismandtype2diabetickidneydiseaseinaHan population of Shandong Province

LI Mei-ye，JIANG Zhao-shun，QV Wei，et al.Department of Endocrinology，the General Hospital of Jinan Military Command，Jinan，Shandong 250031，China

［Abstract］ObjectiveToinvestigatetheassociationbetweenTIM-1genepolymorphismandthe susceptibility of type 2 diabetic kidney disease in a Han population of Shandong Province.MethodsIn this case-control study，112 cases of type 2 diabetic kidney disease patients and 201 normal controls were collected. The two SNPs of TIM-1 gene：rs1039438 and rs6878732 in both groups were analyzed.Improved PCR-RFLP by their genotype frequency and allele frequency were calculated and compared.ResultsA significant difference between the DKD and control groups was found in the rs1039438 genotype and allele，no significant difference was found in rs6878732.ConclusionThe rs1039438 SNP polymorphism of TIM-1 gene might be associated with susceptibility of type 2 diabetic kidney disease.allele G could increase the risk of this disease，while allele A might be a protective factor.

［Key words］TIM-1；Diabetic kidney disease；Gene polymorphism；Case-control study；Improved PCR-RFLP