楊雪薇,楊 爽,董冰雪,郭魯強,劉 暉,滕樂生

(1.吉林大學 生命科學學院,長春 130012;2.吉林大學第四醫(yī)院 藥學部,長春 130011)

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用統(tǒng)計學方法優(yōu)化硝苯地平脂質體處方

楊雪薇1,楊 爽1,董冰雪1,郭魯強1,劉 暉2,滕樂生1

(1.吉林大學 生命科學學院,長春 130012;2.吉林大學第四醫(yī)院 藥學部,長春 130011)

采用乙醚注入法制備硝苯地平脂質體,在單因素實驗基礎上用Box-Behnken設計實驗,并用統(tǒng)計學方法考察磷脂量、脂藥比和膽固醇磷脂比對脂質體包封率的影響.結果表明:多元二次回歸模型最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質體平均包封率為86.54%;人工神經網(wǎng)絡模型結合遺傳算法最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質體平均包封率為97.25%;與二次回歸模型相比,人工神經網(wǎng)絡模型更適于優(yōu)化硝苯地平脂質體的制備.優(yōu)化后得到最佳制備處方為：磷脂量612.4 mg,脂藥比為60.02,磷脂膽固醇比為6.401.

硝苯地平；脂質體；乙醚注入法；Box-Behnken；人工神經網(wǎng)絡

硝苯地平(nifedipine)是鈣離子拮抗劑類藥物的典型代表,為黃色結晶粉末或針狀晶體,在臨床上用于心絞痛、高血壓及心衰的治療[1-2].但硝苯地平存在水中溶解度小、制劑生物利用度低、對光敏感、遇光分解產物有毒和穩(wěn)定性差等缺點.研究表明,脂質體制劑可顯著提高藥物的治療指數(shù),減少給藥次數(shù),從而降低藥物的不良反應,是一種高效低毒的新型給藥系統(tǒng)[3-4].由于脂質體處方的設計較復雜,因此采用單因素設計等常規(guī)方法不易得到最優(yōu)結果.人工神經網(wǎng)絡(ANN)是基于生物神經網(wǎng)絡的非線性計算模型,通過網(wǎng)絡結構相互關聯(lián)節(jié)點的數(shù)學模型模擬人腦學習過程[5].在神經網(wǎng)絡建立后,其內存空間被遺傳算法(GA)充分利用,GA是非線性的最優(yōu)化形式[6].本文采用統(tǒng)計學方法優(yōu)化硝苯地平脂質體的處方,應用Box-Behnken設計實驗,利用多元二次回歸模型[7-8]和ANN模型結合GA對硝苯地平脂質體處方進行篩選.

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

LC-10AVP型高壓液相色譜儀(日本島津公司)；BS224S型電子天平(德國賽多利斯公司)；PhD D3-L型高壓均質機(美國Phdtech公司)；5810R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司).硝苯地平(陜西惠誠生物科技有限公司)；硝苯地平標準品(中國藥品生物制品檢定所)；蛋黃卵磷脂(廣州漢方有限公司)；膽固醇(上?；菔郎噭┯邢薰?；甲醇和乙腈為色譜純;無水乙醚等其他試劑為分析純.

1.2方法

1.2.1 乙醚注入法制備硝苯地平脂質體 取適量卵磷脂、膽固醇和硝苯地平,加入一定量乙醚攪拌,溶解.將乙醚溶液用注射器快速注入已恒溫至30 ℃的45 mL去離子水中,30 ℃攪拌2 h,使乙醚揮發(fā)盡,制成脂質體.用高壓均質法進行整粒,均質壓力為55 MPa,共均質8次[9].

1.2.2 硝苯地平質量濃度測定 HPLC條件：色譜柱為460 mm×150 mm的C18柱,檢測波長為205 nm,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃.流動相為V(乙腈)∶V(水)=1,進樣量20 μL[10].先將10 mg硝苯地平標準品配置成200 μg/mL的硝苯地平乙醇母液,再用逐級稀釋的方法配置各溶液,用0.22 μm有機濾膜過濾后,依次進樣.

1.2.3 包封率測定 取制備的硝苯地平脂質體100 μL,甲醇破乳,過0.22 μm濾膜后注入高效液相色譜儀測定.取5 mL硝苯地平脂質體于8 000 r/min離心30 min后,取上清液100 μL,甲醇破乳,過0.22 μm濾膜后注入高效液相色譜儀測定,計算包封率.

1.2.4 單因素試驗優(yōu)化脂質體制備處方

1)磷脂量的考察：稱取硝苯地平10 mg,膽固醇100 mg,分別稱取蛋黃卵磷脂200,300,400,500,600,700 mg,按1.2.1方法進行操作,得到脂質體.

2)脂藥比的考察：稱取蛋黃卵磷脂600 mg,膽固醇100 mg,分別稱取m(蛋黃卵磷脂)∶m(原料藥)=20,40,60,80,100,120,按1.2.1方法進行操作,得到脂質體.

3)膽固醇磷脂比的考察：稱取蛋黃卵磷脂600 mg,硝苯地平7.5 mg,膽固醇適量,分別使m(膽固醇)∶m(蛋黃卵磷脂)=0,1∶24,1∶12,1∶8,1∶6,1∶4,按1.2.1方法操作,得到脂質體.

1.2.5 Box-Behnken效應面優(yōu)化處方設計 在單因素基礎上,進行3因素3水平的中心組合設計實驗,按表1的因素水平表進行15組實驗,測定脂質體包封率,以包封率為指標進行優(yōu)化.實驗結果采用多元二次回歸模型分析.

表1 Box-Behnken因素水平表Table 1 Variables in Box-Behnken design

1.2.6 人工神經網(wǎng)絡模型優(yōu)化處方 從Box-Behnken設計試驗中隨機抽取一組數(shù)據(jù)作為預測集和測試集,其他數(shù)據(jù)作為校正集.3層反饋給人工神經網(wǎng)絡模型,由于一些隱藏節(jié)點對人工神經網(wǎng)絡模型影響較大,因此采用接近標準程度(Da)選擇合適的隱藏節(jié)點：

(1)

其中:MSEc和MSEt為校準設置和驗證設置的均方誤差(MSE);nc和nt為校準設置和驗證設置的數(shù)量;n為校準設置和驗證設置的總數(shù);c為調整較好Da的一個連續(xù)數(shù)字(本文c=1 000).所得結果用MATLAB7.6.0.324(R2008a,美國MathWorks公司)軟件分析.

人工神經網(wǎng)絡模型確立后,用GA在測試區(qū)域內搜尋最優(yōu)值.GA參數(shù)為：群體類型為雙重向量,群體容量為20,初始群體隨機給出,作為隨機統(tǒng)一的選擇功能,精確算法為2,交叉率為0.8,交叉作用是離散的,遷移率為0.2,罰因子為100,用GA得到的世代數(shù)目為100.擬合度定義為

(2)

其中NTANN model為通過神經網(wǎng)絡模型計算得到的NT值.

1.2.7 驗證試驗 為檢驗多元二次回歸模型和人工神經網(wǎng)絡模型預測處方的準確性與可行性,分別用各自得到的最佳處方配比制備硝苯地平脂質體,進行3次平行驗證試驗.

2 結果與討論

2.1硝苯地平標準曲線的繪制以色譜峰面積為縱坐標,標準溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線,得回歸方程y=77 476.023 98x-21 820.591 56,R2=0.999 73,表明硝苯地平在5～40 μg/mL內線性關系良好.

2.2單因素試驗結果

因素X1,X2,X3對硝苯地平脂質體包封率的影響如圖1所示.由圖1可見,X1,X2,X3的最佳值分別為600 mg,80,1∶6.因此確定以最佳條件為中心組合實驗的中心點進行優(yōu)化.

圖1 X1(A),X2(B)和X3(C)對包封率的影響Fig.1 Effects of X1(A),X2(B)and X3(C)on the encapsulation efficiency of liposome

2.3Box-Behnken中心組合實驗優(yōu)化處方設計結果

中心組合實驗結果列于表2,多元二次回歸分析結果列于表3.

表2 Box-Behnken中心組合設計方案及試驗結果Table 2 Matrix of Box-Behnken design and the corresponding experimental results

擬合得到回歸方程為

(3)

該模型P=0.003 021,相關系數(shù)R2=96.85%,表明96.85%的實驗數(shù)據(jù)均符合該模型擬合,即該方程的擬合充分,回歸方程高度顯著,模型準確可行.

表3 多元二次回歸分析結果Table 3 Statistical results of multivariate quadratic regression analysis

回歸分析結果的響應曲面如圖2所示.由圖2可見,在檢測范圍內,3個響應曲面均為開口向下的凸形曲面,表明響應值(提取率)存在極高值,其等高線中心均位于-1～1,表明提取的最優(yōu)條件存在于所設計的因素水平范圍內.圖2(C)中的等高線呈橢圓形,且坐標軸與橢圓形軸線間存在較大的夾角,表明X1和X3間存在顯著的交互作用.計算得到最優(yōu)提取條件的編碼值為：X1=-0.038 66,X2=-0.600 75,X3=-0.052 58,代入變換公式可得Z1=596.134 mg,Z2=67.985,Z3=5.947,即最佳處方為：磷脂質量596.134 mg,m(脂)∶m(藥)=67.985,m(膽固醇)∶m(磷脂)=1∶5.947,由回歸方程可得包封率的預測值為93.065%.

圖2 響應面和等高線圖Fig.2 Responsive surfaces and contours

2.4人工神經網(wǎng)絡模型結果

人工神經網(wǎng)絡模型結果如圖3所示.由圖3可見,第11個節(jié)點Da值最大.當隱藏的節(jié)點數(shù)設定為11時,優(yōu)化后神經網(wǎng)絡模型的決定系數(shù)R2=0.951 6,表明人工神經網(wǎng)絡模型可靠.世代數(shù)對擬合度的影響如圖4所示.由圖4可見:當世代數(shù)為31時,擬合度最低；世代數(shù)繼續(xù)增長時,擬合度基本保持不變.通過GA獲得優(yōu)化后培養(yǎng)條件的編碼值為：U1=0.124,U2=-0.999,U3=0.401; 對應的實驗值為：W1=612.4 mg,W2=60.02,W3=6.401.在優(yōu)化后處方條件下的預期包封率為98.457 8%.

圖3 隱藏層節(jié)點數(shù)對Da的影響Fig.3 Effect of the number of hidden nodes on Da

圖4 世代數(shù)對擬合度的影響Fig.4 Effect of the number of generations on fitness

2.5驗證試驗結果

多元二次回歸模型最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質體平均包封率為86.54%,與預測值的相對誤差為4.62%;人工神經網(wǎng)絡模型最優(yōu)處方制備的硝苯地平脂質體平均包封率為97.25%,與預測值的相對誤差為0.86%.兩組驗證試驗結果表明,人工神經網(wǎng)絡模型更適于制備硝苯地平脂質體.

綜上所述,本文采用乙醚注入法制備硝苯地平脂質體,高壓均質法進行整粒,在單因素實驗基礎上,采用Box-Behnken設計實驗,通過多元二次回歸模型和人工神經網(wǎng)絡模型結合GA算法,考察了m(磷脂)、m(脂)∶m(藥)、m(膽固醇)∶m(磷脂)對脂質體包封率的影響.結果表明,與多元二次回歸模型相比,人工神經網(wǎng)絡模型更適于制備硝苯地平脂質體,優(yōu)化后最優(yōu)處方為m(磷脂)=612.4 mg,m(脂)∶m(藥)=60.02,m(膽固醇)∶m(磷脂)=1∶6.401,其包封率為97.25%.

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(責任編輯：單 凝)

OptimizethePreparationFormulationofNifedipineLiposomebyStatisticalMethods

YANG Xuewei1,YANG Shuang1,DONG Bingxue1,GUO Luqiang1,LIU Hui2,TENG Lesheng1

(1.CollegeofLifeScience,JilinUniversity,Changchun130012,China；2.DepartmentofPharmacy,TheFourthHospitalofJilinUniversity,Changchun130011,China)

The nifedipine liposome was prepared from an appropriate amount of lecithine,cholesterol and nifedipine by the ether injection method.On the basis of single factor experiment,we used statistical methods to investigate the effects of phospholipid amount,lipid drug ratio,cholesterol phospholipid ratio on the encapsulation efficiency of liposome.The results show that the encapsulation rate of the liposome prepared based on multivariate quadratic regression model was 86.54%,and the encapsulation rate of the liposome prepared based on artificial neural network model was 97.25%.Compared with the quadratic regression model,artificial neural network model combined with genetic algorithm is more suitable for optimizing the preparation technique of nifedipine liposome.After optimizing,the best preparation formulation is 612.4 mg of phospholipid with a lipid drug ratio of 60.02 and a cholesterol phospholipid ratio of 6.401.

nifedipine;liposome;ether injection method;Box-Behnken;artificial neural network

10.13413/j.cnki.jdxblxb.2015.03.41

2014-07-14.

楊雪薇(1990—),女,漢族,碩士研究生,從事生物制藥技術的研究,E-mail:yangxw1309@163.com.通信作者：滕樂生(1983—),男,漢族,博士,副教授,從事生物制藥技術的研究,E-mail:tenglesheng@jlu.edu.cn.

R944

：A

：1671-5489(2015)03-0572-05