劉艷菊，李曉飛，凡　杭，魯利娜

熒光光譜及分子模擬研究β-欖香烯與牛血清白蛋白的相互作用

劉艷菊，李曉飛，凡杭，魯利娜

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450046）

在模擬生理pH條件（pH=7.40）下，用熒光光譜和分子模擬法研究β-欖香烯與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。在308K和318K溫度下，激發(fā)波長（λex）為280nm，測(cè)定BSA在340nm的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨著β-欖香烯濃度增加的變化，用分子對(duì)接方法研究β-欖香烯與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。β-欖香烯與牛血清白蛋白的反應(yīng)機(jī)制為靜態(tài)猝滅，作用力類型為疏水作用。分子模擬結(jié)果表明：β-欖香烯與牛血清白蛋白亞結(jié)構(gòu)域A結(jié)合，二者之間有疏水作用和靜電作用，且以疏水作用為主，這與熒光光譜結(jié)果一致。β-欖香烯與BSA具有較強(qiáng)的相互作用，以血清白蛋白為載體，β-欖香烯作為藥物可通過血液循環(huán)到達(dá)病變部位，發(fā)揮藥效。

β-欖香烯；牛血清白蛋白；熒光光譜；分子模擬

doi：10.11857/j.issn.1674-5124.2015.09.012

0　引言

β-欖香烯是從中藥莪術(shù)中提取的一種抗腫瘤有效成分［1］，是只含C，H兩種元素的倍半萜烯［2］。其乳劑作為國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤新藥已廣泛用于臨床［3］，其細(xì)胞毒性及不良反應(yīng)均小于一般的化療藥物，對(duì)肝、腎功能無損害，無骨髓抑制，具有抑制腫瘤細(xì)胞和提高免疫功能的雙重療效。研究還發(fā)現(xiàn)β-欖香烯對(duì)已耐藥的腫瘤細(xì)胞仍敏感，不易產(chǎn)生耐藥性，是一種廣譜、高效、副作用少的抗腫瘤藥物。因其具有增強(qiáng)免疫、抗耐藥、放化療協(xié)同等特點(diǎn)，與其他抗腫瘤藥物相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［4］。

血清白蛋白是血漿中最豐富的可溶性蛋白，它產(chǎn)生于動(dòng)物的肝臟并且保持動(dòng)物血液的滲透壓平衡，對(duì)許多內(nèi)源性和外源性的藥物都具有很高的親和力，研究中藥活性成分與白蛋白的相互作用，對(duì)闡述中藥活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)機(jī)制有著重要作用［5］。血清白蛋白是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶點(diǎn)［6］，藥物進(jìn)入血漿后，首先與血清白蛋白結(jié)合，然后再被運(yùn)送到身體各部位發(fā)揮藥效。因此，藥物與血清白蛋白結(jié)合程度直接影響藥物在生物體內(nèi)的分布、貯存、轉(zhuǎn)運(yùn)、藥效、藥物代謝以及毒副作用等方面的性質(zhì)［7］。研究藥物小分子與血漿白蛋白之間相互作用不僅有助于從分子水平闡明藥物的作用機(jī)理，而且對(duì)抗腫瘤藥物的體外篩選具有重要意義，同時(shí)也為藥物設(shè)計(jì)提供了理論指導(dǎo)［8］。

本文利用熒光光譜法研究了β-欖香烯在生理?xiàng)l件下與牛血清白蛋白的相互作用，探討相互作用機(jī)理，以及對(duì)蛋白構(gòu)象的影響，求出了結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；并利用分子模擬研究了β-欖香烯與牛血清白蛋白的作用力類型，結(jié)果表明二者之間有疏水作用和靜電作用，且以疏水作用為主，這與熒光光譜結(jié)果一致，為探明β-欖香烯在體內(nèi)的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

F-4500型熒光分光光度計(jì)（日本島津）；PHS-3C型酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀表有限公司，中國）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器。

圖1　β-欖香烯的結(jié)構(gòu)

圖2　308K和318K時(shí)BSA熒光強(qiáng)度隨β-欖香烯濃度的變化圖

1.0×10-5mol/L牛血清白蛋白溶液（BSA，北京奧克星生物技術(shù)有限公司，相對(duì)分子量65000）；1.0× 10-4mol/Lβ-欖香烯溶液（標(biāo)準(zhǔn)品，99.2%，中國藥品生物制品鑒定所，圖1為β-欖香烯分子結(jié)構(gòu)）；含0.1mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖溶液，pH=7.40（Tris，BR，≥99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

用25mL移液管準(zhǔn)確移取13.5mL Tris-HCl緩沖溶液于100mL燒杯中，用微量進(jìn)樣器向其中加入BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5mL，混合均勻，然后用微量進(jìn)樣器向其中依次加β-欖香烯（0～1.0×10-4mol/L），混合均勻，置于實(shí)驗(yàn)溫度下（308，318K）），恒溫5min，在激發(fā)波長為280nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5.0nm的條件下，測(cè)定BSA的熒光光譜及固定Δλ值的同步熒光光譜隨著β-欖香烯量增加的變化。

2　結(jié)果與討論

2.1β-欖香烯對(duì)BSA的熒光猝滅作用

BSA分子內(nèi)因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，圖2給出了在保持BSA濃度不變，308K和318K溫度下，激發(fā)波長（λex）為280nm條件下，BSA內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨著β-欖香烯濃度增加的變化情況。此時(shí)熒光發(fā)射主要來自BSA色氨酸殘基，最大發(fā)射波長（λem）為340nm，且隨著β-欖香烯物質(zhì)量濃度的增加，來自BSA色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度逐漸減弱（見圖2小圖），表明BSA色氨酸殘基的熒光能有效地被β-欖香烯猝滅；但最大發(fā)射峰的位置及發(fā)射光譜的形狀基本不變［9］，說明β-欖香烯與BSA之間形成了熒光較弱或者無熒光的復(fù)合物而造成BSA內(nèi)源性熒光被猝滅。

2.2β-欖香烯對(duì)BSA熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅根據(jù)其發(fā)生原因可分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。靜態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)射熒光或熒光較小的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光降低；動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間相互碰撞而導(dǎo)致的熒光猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅遵循Stern-volmer方程［10］：

式中：Kq——雙分子猝滅過程速率常數(shù)；

Ksv——Stern-volmer方程的猝滅常數(shù)；

τ0——沒有猝滅劑存在下生物大分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約為10-8s［11］；

F0、F——未加入和加入猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；

［Q］——猝滅劑β-欖香烯的物質(zhì)量濃度。

本文研究了308K和318K下的BSA與β-欖香烯相互作用的熒光光譜，利用不同溫度下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以F0/F對(duì)β-欖香烯的物質(zhì)量濃度作圖，結(jié)果如圖3所示。

圖3　308K和318K時(shí)β-欖香烯對(duì)BSA的Stern-volmer方程

由圖3及式（1）得出不同溫度下β-欖香烯與BSA相互作用的猝滅常數(shù)及猝滅速率常數(shù)，如表1所示。

表1　β-欖香烯與BSA不同溫度下相互作用的常數(shù)

由表1及圖3可知，對(duì)Stern-volmer猝滅方程線性擬合，得到308K和318K時(shí)對(duì)應(yīng)的Stern-volmer猝滅常數(shù)分別為1.28×105L/mol和1.24×105L/mol；再由Ksv=Kqτ0，可求得猝滅過程的速率常數(shù)Kq分別為1.28×1013L/（mol·s），1.24×1013L/（mol·s）。兩個(gè)溫度下猝滅過程的速率常數(shù)的數(shù)量級(jí)都在1013，而各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L/（mol·s），β-欖香烯對(duì)BSA的熒光猝滅速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率。由此判斷β-欖香烯對(duì)BSA的相互作用是因形成復(fù)合物而引起B(yǎng)SA內(nèi)源性熒光猝滅，屬于靜態(tài)猝滅［12］。

2.3β-欖香烯與BSA作用的結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

在靜態(tài)猝滅中，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可以通過雙對(duì)數(shù)公式求出，當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)，其表觀結(jié)合常數(shù)Kb與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可由式（2）［13］求出。

做lg［（F0-F）/F］對(duì)lg［Q］的圖（見圖4），根據(jù)截距和斜率求得β-欖香烯與BSA作用的結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，所得結(jié)果列于表2。

表2　β-欖香烯與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

從表中數(shù)據(jù)可知，β-欖香烯與BSA的結(jié)合常數(shù)Kb較大，并能形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且隨著溫度的升高，結(jié)合常數(shù)亦有明顯增加，說明β-欖香烯與白蛋白的結(jié)合能力受溫度影響較大。結(jié)果表明β-欖香烯與BSA具有較強(qiáng)的相互作用，以血清白蛋白為載體，β-欖香烯作為藥物可通過血液循環(huán)到達(dá)病變部位，從而發(fā)揮藥效，達(dá)到治病的目的。

2.4β-欖香烯與BSA相互作用的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力類型

中藥活性成分與血清白蛋白的分子間作用力包括氫鍵、范德華力、疏水作用力、靜電引力等。不同藥物與白蛋白的結(jié)合力類型也不同，藥物與白蛋白之間的作用力類型的確定可根據(jù)二者作用前后焓變?chǔ)?r H m和熵變?chǔ)?r S m來判斷，當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變?chǔ)?r H m可認(rèn)為是常數(shù)。

由熱力學(xué)式（3）～式（5）及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可求得β-欖香烯與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3所示。

表3　不同溫度下β-欖香烯對(duì)BSA的熱力學(xué)常數(shù)

一定條件下，藥物與白蛋白的結(jié)合反應(yīng)是否能自發(fā)進(jìn)行與體系的吉布斯自由能有關(guān)，吉布斯自由能為負(fù)值時(shí)，反應(yīng)能夠自發(fā)進(jìn)行。這種自發(fā)過程可分為熵驅(qū)動(dòng)和焓驅(qū)動(dòng)。熵焓的大小與作用力類型之間的關(guān)系如下：ΔS＞0可能是疏水和靜電作用力；ΔS＜0可能為氫鍵和范德華力；當(dāng)Δ H ＞0 且Δ S ＞0時(shí)，為疏水作用力；當(dāng)Δ H ＜0 且Δ S ＜0時(shí)，為氫鍵或范德華力；當(dāng)Δ H ≈0 ，Δ S ＞0時(shí)，作用力為靜電引力；Δ H ＜0時(shí)，主要為靜電作用力［8］。由表3的數(shù)據(jù)可知，β-欖香烯與B S A作用的熱力學(xué)常數(shù)為Δ r H m ＞0 、Δ r S m ＞0，根據(jù)藥物與B S A作用的熱力學(xué)規(guī)律，β-欖香烯和B S A之間存在較強(qiáng)的疏水作用力。由于Δ r G m ＜0，表明β-欖香烯與B S A的相互作用過程是自發(fā)的［14］。

圖4　308K和318K時(shí)β-欖香烯對(duì)BSA的雙對(duì)數(shù)圖

2.5β-欖香烯對(duì)BSA構(gòu)象的影響

BSA分子中因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光，其中色氨酸和酪氨酸的熒光強(qiáng)度比較大，且二者的激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴(yán)重重疊，利用同步熒光光譜選擇合適的Δλ可以達(dá)到簡化光譜、窄化譜帶和減少光譜重疊的目的。通常情況下，Δλ=60nm的同步熒光光譜只顯示色氨酸的特征光譜，Δλ=15nm的同步光譜只顯示酪氨酸的特征光譜。根據(jù)同步熒光光譜發(fā)射波長的變化可以推測(cè)β-欖香烯的加入對(duì)BSA色氨酸和酪氨酸微環(huán)境產(chǎn)生的影響，進(jìn)而可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

圖5　308K時(shí)β-欖香烯與BSA的同步熒光光譜

圖5為308K時(shí)，β-欖香烯與BSA相互作用的同步熒光光譜。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，因此，根據(jù)最大發(fā)射波長的改變可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。隨著β-欖香烯濃度的增加，酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光光譜強(qiáng)度明顯降低。酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長稍有藍(lán)移，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本不變，表明酪氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性增加，β-欖香烯的加入引起了BSA構(gòu)象的變化，其原因可能是β-欖香烯嵌插BSA分子內(nèi)部引起的［15］。

2.6β-欖香烯與BSA的分子模擬研究

BSA是由582個(gè)氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質(zhì)。每個(gè)結(jié)構(gòu)域均含有A、B兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域［16］。在亞結(jié)構(gòu)域A中存在一個(gè)很大的疏水腔，絕大部分藥物小分子都與該亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合。分子對(duì)接結(jié)果表明，β-欖香烯位于Leu218、Phe22、Leu233、Ile263、Ala260、Leu259、Ile289等氨基酸圍成的疏水空腔中，說明β-欖香烯與BSA間存在明顯的疏水作用，從而使BSA內(nèi)在熒光強(qiáng)度降低。BSA與β-欖香烯分子間除存在疏水作用力外，還可能存在靜電作用力，β-欖香烯的C=C雙鍵所處的位置附近有Ser286、His241等極性氨基酸。所以β-欖香烯與BSA的相互作用可能主要有疏水作用、靜電作用，且以疏水作用為主。血清白蛋白的結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，它和藥物之間往往存在幾種作用力類型，分子模擬的研究結(jié)果顯示有靜電作用的存在，是對(duì)熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)有效補(bǔ)充，二者并不矛盾。

對(duì)接實(shí)驗(yàn)同時(shí)給出了在298 K時(shí)二者相互作用的結(jié)合自由能ΔrG m為26.04 kJ/mol，根據(jù)表3可以計(jì)算出298 K時(shí)自由能ΔrG m的實(shí)驗(yàn)值為25.86 kJ/mol，計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值非常接近，表明分子對(duì)接結(jié)果較為可靠。

3　結(jié)束語

本文采用熒光光譜和分子模擬研究了β-欖香烯對(duì)BSA的相互作用，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果求出猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)等，揭示了β-欖香烯對(duì)BSA的猝滅機(jī)理、結(jié)合方式以及β-欖香烯對(duì)BSA構(gòu)象的影響，實(shí)驗(yàn)和分子模擬得出β-欖香烯與BSA的作用力類型。

β-欖香烯對(duì)BSA的內(nèi)源性熒光進(jìn)行猝滅，其猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，β-欖香烯與BSA之間的相互作用為自發(fā)過程，且結(jié)合作用較強(qiáng)。β-欖香烯與蛋白質(zhì)結(jié)合于亞結(jié)構(gòu)域A中，疏水作用為主要作用力，但同時(shí)存在靜電作用。β-欖香烯與BSA的結(jié)合改變了BSA的分子構(gòu)象。

在分子水平上了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況，并在闡明β-欖香烯與BSA的作用機(jī)制方面具有重要的指導(dǎo)意義，為β-欖香烯作為抗腫瘤藥物作用機(jī)理的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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Study on interaction betweenβ-elemene and bovine serum album in by fluorescence spectroscopy and molecular modeling

LIU Yanju，LI Xiaofei，F(xiàn)AN Hang，LU Lina
（Pharmacy College，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China）

The interaction betweenβ-elemene and bovine serum albumin is studied by fluorescence spectroscopy and molecular modeling under the simulative human physiological condition（pH=7.40）. At different temperatures（308K and 318 K），excitation wavelength（λex）is set as 280 nm to detect the variation of the bovine serum albumin（BSA）in 340 nm endogenous fluorescent intensity whenβ-elemene is added.Then，the interaction between theβ-elemene and BSA is analyzed by molecular modeling.The reaction mechanism of the two substances is static quenching，and the binding force thereof is hydrophobic interaction.The molecular modeling indicates that theβ-elemene is bonded with the subdomain A of bovine serum albumin through hydrophobic and electrostatic interactions，and the hydrophobic interaction is the predominant intermolecular force.This complies with the results acquired by fluorescence spectroscopy.Theβelemene and BSA are highly interacted；the former when made into medicines can be sent along with bloodstream to the pathogenic areas through the serum albumin of the latter as a carrier.

β-elemene；BSA；fluorescence spectroscopy；molecularmodeling

A

1674-5124（2015）09-0051-05

2015-01-14；

2015-03-07

河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助項(xiàng)目（2012GGJS-091）；河南中醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（2014XCXRC04）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（12B150014）；河南省科技廳技術(shù)攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（102102310321）

劉艷菊（1979-），女，河南周口市人，副教授，博士，主要從事藥物活性單元構(gòu)筑的功能配合物研究。