李琦，成莉鳳，曾潔，李國高，劉正初，*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙410128;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205;3.湖南利爾康生物股份有限公司，湖南岳陽414100;)

草本纖維在進行綜合利用前，都必須經(jīng)過“脫膠”工序以去除“膠質(zhì)”(主要是果膠、半纖維素和木質(zhì)素等非纖維素物質(zhì))。麻類紡織品是草本纖維工業(yè)化應(yīng)用的代表之一，因其具有抗菌、吸汗、防紫外線等特點深受消費者歡迎。美中不足的是，麻類制品若采用化學(xué)脫膠法脫膠，排放的污水不僅會對環(huán)境造成很大污染，同時對麻纖維本身也會造成不同程度的損傷。這在素有“中國草”之稱的苧麻領(lǐng)域表現(xiàn)尤為突出。生物脫膠方法因可以節(jié)約大量的化工原料和能源、減輕脫膠廢水、提高纖維品質(zhì)等優(yōu)點越來越受到人們的重視[1]。

生物脫膠主要利用脫膠菌分泌的胞外酶系——果膠酶、半纖維素酶等混合酶液降解麻類韌皮纖維中的膠質(zhì)。生物脫膠主要有加菌法和加酶法兩種[2]。加菌法主要依靠高效脫膠菌在生長繁殖過程中分泌果膠酶等胞外酶實現(xiàn)脫膠。果膠等雜質(zhì)可作為微生物生長繁殖的碳源，而分泌的酶又可以分解果膠，是一個“膠養(yǎng)菌——菌產(chǎn)酶——酶脫膠”的循環(huán)過程[3];加酶法則直接向脫膠液中添加果膠酶等商品酶制劑，使酶直接作用于韌皮纖維以實現(xiàn)脫膠。二種方法各有利弊，但都涉及到了麻類脫膠關(guān)鍵基因——果膠酶基因。

實驗室篩選到了一株擁有14個果膠酶基因的麻類脫膠高效菌株DCE01。為了深入研究麻類脫膠機理，提高麻類脫膠效率，本文克隆了該菌株的果膠酶基因Pel325，在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中用表達載體pET－28a進行了表達，并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株DCE01由本實驗室分離與保藏;E.coli BL21購自Novagen公司;載體pET－28a購自TransGen公司;聚半乳糖醛酸鈉、橘子果膠 (20% －34%esterified)、橘子果膠 (55% －70%esterified)、橘子果膠 (≥85%esterified)購自Sigma公司;UNIQ－10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、多功能DNA純化回收試劑盒購自上海生工;其他常規(guī)生化試劑均為分析純，購自國藥集團。超聲波破碎儀購自美國Branson公司;PCR儀購自BioRad公司;DYY－12型電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

DCE01菌種的活化[4]方法:從保藏斜面挑取菌種一環(huán)接種到5 mL改良肉湯培養(yǎng)基，靜置于35℃環(huán)境活化培養(yǎng)5－8 h;然后，稀釋涂布固體改良肉湯培養(yǎng)基，35℃靜置培養(yǎng)18－20 h，分離單菌落;挑選生長旺盛的單菌落接種于5 mL LB培養(yǎng)基，35℃，180 r/min培養(yǎng)15－18 h后待用。

1.2.2 基因組DNA的提取

參照UNIQ－10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進行。

1.2.3 Pel325基因的克隆

采用軟件Primer premier 5設(shè)計引物。上游引物帶BamH I酶切位點，下游引物帶Hand III酶切位點。引物如下:

以基因組DNA為模板，設(shè)置擴增參數(shù)為:95℃預(yù)變性4.0 min，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1.0 min，共30個循環(huán)，72℃保溫10 min。

1.2.4 重組質(zhì)粒的酶切

將經(jīng)過驗證的克隆載體重組質(zhì)粒進行大體積酶切。酶切反應(yīng)體系:10×PCR Buffer5.0 μL;重組質(zhì)粒DNA 10.0 μL;酶 (BamH I、Hand III)各5.0 μL;用無菌去離子水補足到50 μL，37℃酶切30 min，用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。

1.2.5 Pel325基因的轉(zhuǎn)化

加連接產(chǎn)物于100 μL E.coli BL21(DE3)剛剛解凍的感受態(tài)細胞中，輕彈混勻，冰浴30 min。42℃熱擊90s，立刻至于冰上，冰浴10 min。加入800 μL平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，120 r/min，37℃孵育2.0 h。取200 μL菌液涂布含有100 μg/mL的Amp的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜。

1.2.6 Pel325基因的誘導(dǎo)表達及粗酶液的制備

挑取陽性基因工程菌接種一環(huán)到5.0 mL含有100μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)15－18 h后，接種 (接種量2%)到100 mL的LB培養(yǎng)液，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD600到達0.6后，添加IPTG至終濃度1.0 mmol/L進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)條件為30℃，200 r/min。在第8h、21 h分別取樣并檢測。

1.2.7 蛋白質(zhì)SDS－PAGE電泳

5%濃縮膠，12%的分離膠，濃縮膠和分離膠分別采用10 mA、25 mA穩(wěn)流電泳。

1.2.8 Pel325基因果膠酶活力測定[5]

底物采用pH 9.0的甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液配置。取2.0 mL底物預(yù)熱至50℃，然后添加1.0 mL適當(dāng)稀釋的酶液，50℃準確反應(yīng)5 min，立即加入2.0 mL DNS，沸水浴中顯色5.0 min后，冰水浴迅速冷卻，加蒸餾水定容至15 mL。以煮沸滅活的相同酶液做陰性對照，測定樣品的OD520。

上述條件下，底物每分鐘釋放出相當(dāng)于1.0 μmol半乳糖醛酸的還原糖所需的酶量為1個酶活力單位，以“U/mL”表示。

1.2.9 果膠酶酶學(xué)性質(zhì)分析

在pH 9.0條件下，分別測定胞內(nèi)酶與胞外酶的溫度特征曲線，以確定其最適溫度;在溫度50℃條件下，分別測定胞內(nèi)酶pH7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0時的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pel325基因克隆

用0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測麻類脫膠Pel325基因的克隆情況，電泳條帶清晰顯示，大小約為1000bp左右，這與測序結(jié)果相符，測序結(jié)果顯示該基因含有963個堿基，編碼320個氨基酸。

圖1 Pel325基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of gene Pel325

2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與酶切

質(zhì)粒酶切及質(zhì)粒PCR的0.7%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，在1000bp左右，均有較為明顯的條帶，說明目標基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化。

圖2 質(zhì)粒PCR鑒定與擴增檢測Fig.2 Detection of recombinants by PCR

2.3 蛋白質(zhì)SDS－PAGE電泳

未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌株在39kDa附近沒有條帶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8h后，出現(xiàn)了較為明顯的條帶，說明蛋白表達成功。

圖3 生物脫膠酶SDS－Page電泳Fig.3 SDS－PAGE of recombinant enzyme of biologic degumming

2.4 果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

隨著溫度的升高，酶活也開始升高，但是，當(dāng)溫度超過55℃時，酶活急劇下降，65℃時酶的活性不到55℃的四分之一。在pH8.0時，酶活達到最大值，之后開始緩慢下降，至pH11時，幾乎沒有酶活，說明該酶在堿性條件下可以使用，但是，最佳使用條件應(yīng)是弱堿性環(huán)境。當(dāng)分別采用聚半乳糖醛酸鈉 (底物1)、橘子果膠 (20% －34%酯化度，底物2)、橘子果膠 (55% －70%酯化度，底物3)、橘子果膠 (酯化度≥85%，底物4)為底物檢測酶活時，發(fā)現(xiàn)果膠酶酶活隨著酯化度的增加而升高。

圖4 溫度對重組酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of recombinant enzyme

圖5 pH對重組酶的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of recombinant enzyme

圖6 不同底物對酶活力的影響Fig.6 Effect of substrates on the activity of recombinant enzyme

3 討論

果膠酶Pel325在堿性條件下有較高的活力，但是，當(dāng)pH超過10時，酶活呈下降趨勢。該酶在pH7.5－8.5的酶活較pH9.5時高，這與同菌株分泌表達的另一種基因PelG403有顯著的不同，后者在pH8.5時的酶活不及pH9.5時的五分之一[6]?？赡苷且驗槟軌蚍置诙喾N不同特性的麻類脫膠生物酶，進而能夠快速適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境與不同的果膠底物，所以才導(dǎo)致了菌株DCE01擁有高效脫膠的能力。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，Pel325含有2個典型的結(jié)構(gòu)域 (Superfamily2.60.40.10和2.160.20.10)，而PelG403僅含有1個 (Superfamily2.160.20.10)，這可能也是導(dǎo)致兩者最佳催化條件有所不同的重要原因之一。

通過序列比對分析發(fā)現(xiàn)，Pel325基因與來自Dickeyadadantii3937的pelI基因[7]較為相似，但是仍然存在差異。在核酸序列上，Pel325與pelI有53個堿基存在差異，而在氨基酸序列上，有9處存在差異。

重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，既有胞內(nèi)酶活性，也有胞外酶活性，總的來說，胞內(nèi)酶活性較胞外酶活性大。隨著底物 (橘子果膠)酯化程度的增加，酶的活性越來越大。這說明，該酶可以催化不同酯化程度的果膠，尤其適合催化高酯化度的果膠。

隨著國家對環(huán)保力度的加強，草本纖維資源的清潔開發(fā)與綜合利用已引起了人們的高度重視[8]。生物脫膠取代傳統(tǒng)的化學(xué)脫膠是大勢所趨。麻類脫膠高效菌株DCE01的基因Pel325在堿性 (pH9.5)條件下有很好的催化效果，在弱堿性 (pH7.5)條件下的酶活更高，有利于進一步減少脫膠工藝堿的消耗，進一步降低工業(yè)污染。通過高密度發(fā)酵、基因定點突變等手段，有望進一步提升脫膠酶的耐溫性、耐酸堿性及發(fā)酵活性，以適應(yīng)工業(yè)化應(yīng)用的需要。

[1]劉正初，張運雄，馮湘沅，等.清潔型草本纖維生物提取工藝的污染機理研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41(2):546－551.

[2]蔣建雄.麻類作物微生物工程研究進展 [J].作物研究，1999，13(1):45－47.

[3]李宗道.麻類生物工程進展[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1999:331－338.

[4]成莉鳳.DCE－01菌株果膠酶基因克隆與表達及其多樣性研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文，2013.

[5]成莉鳳，李琦，劉正初，段盛文，等.DCE－01菌株果膠酯酶基因克隆與表達 [J].食品工業(yè)科技，2013(15):162－165.

[6]成莉鳳，劉正初，段盛文，等.一種果膠裂解酶基因 (pel)表達體系構(gòu)建及其表達產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2013(05):546－553.

[7]GlasnerJD，YangCH，ReverchonS， etal.Genomesequenceoftheplant － pathogenicbacteriumDickeyadadantii3937 [J].JournalofBacteriology.2011，193(8):2076–2077.

[8]劉正初.用科學(xué)發(fā)展觀看我國草本纖維產(chǎn)業(yè)前景[J].中國麻業(yè)科學(xué)，2007，29(增刊):68－71.