木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4雙水相體系中的分配行為

蔡濤，張海德，董安華，彭健，吳蕊，朱英瑞

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南 ?？?570228）

引 言

雙水相體系（aqueous two-phase system，ATPS）是指某些親水性的高分子聚合物與聚合物或聚合物與無機(jī)鹽溶解在水中，超過一定濃度時(shí)能自然地分成互不相溶的兩相或多相的體系[1]。該體系具有操作簡(jiǎn)單、條件溫和等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于核酸、蛋白質(zhì)和病毒等生物產(chǎn)品的分離純化[2-4]，是一種很有前景的新型分離技術(shù)。

離子液體，又稱室溫熔融鹽，是指在室溫或者接近室溫的情況下完全由有機(jī)陽離子和無機(jī)或有機(jī)陰離子組成的熔鹽體系[5]。離子液體具有其他常規(guī)溶劑無可比擬的優(yōu)點(diǎn)[6-10]，如不揮發(fā)、無色、無臭、溶解能力強(qiáng)、蒸氣壓極低、化學(xué)穩(wěn)定性好和通過正負(fù)離子可設(shè)計(jì)目標(biāo)離子液體等。離子液體雙水相體系（ionic liquids aqueous two-phase system，ILATPS）通常由一種有機(jī)鹽（親水性離子液體）、一種無機(jī)鹽（如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物等）和水形成，該雙水相體系綜合了離子液體和雙水相體系的優(yōu) 點(diǎn)[11-12]，開辟了新的萃取分離體系。但是，對(duì)于離子液體雙水相系統(tǒng)的形成機(jī)理和目標(biāo)物質(zhì)在其中的分配行為及規(guī)律缺乏理論解釋。

近年來，對(duì)離子液體雙水相體系的研究十分活躍。王偉濤等[13]用[C4mim]Cl/K2HPO4提取木瓜蛋白酶并對(duì)其做了系統(tǒng)優(yōu)化，木瓜蛋白酶的酶活性回收率可達(dá)到91.2%，純化因子可以達(dá)到1.73。鄧凡政等[14]用[Bmim]BF4/NaH2PO4體系對(duì)牛血清蛋白 提純，結(jié)果表明萃取率可達(dá)到99%。Du 等[15]用[Bmim]Cl/K2HPO4體系對(duì)尿液中的蛋白質(zhì)提純，結(jié)果表明，分配系數(shù)可達(dá)到10，富集因子為5。Ruiz-Angel 等[16]用[Bmim]Cl/K2HPO4體系對(duì)卵清蛋白提純，結(jié)果表明分配系數(shù)可高達(dá)180。王軍等[17]用[Nebm]BF4/KH2PO4體系對(duì)α-淀粉酶提純，結(jié)果表明回收率可達(dá)到98.5%。董安華等[1]用PEG-硫酸銨組成的雙水相進(jìn)行了相平衡數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，并建立了木瓜蛋白酶在該體系中的分配模型，數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)度較高。

離子液體雙水相成相能力的大小與離子液體在水中的溶解性和無機(jī)鹽的鹽析作用有關(guān)，溶解性越差成相能力越強(qiáng)，鹽析作用越弱越不利于分相，研究表明 [Cnmim]BF4較[Cnmim]Cl、[Cnmim]Br 有較強(qiáng)的成相能力。目前關(guān)于木瓜蛋白酶離子液體雙水相萃取的研究主要集中在系統(tǒng)優(yōu)化這一階段，液/液相平衡的測(cè)定較少，對(duì)于其分配模型的研究報(bào)道更少。本工作采用濁點(diǎn)法測(cè)定[Cnmim]BF4-NaH2PO4體系在298.15 K下的雙節(jié)線并進(jìn)行相平衡數(shù)據(jù)的測(cè)定和關(guān)聯(lián)，研究了木瓜蛋白酶的分配系數(shù)與該體系下雙水相組成濃度的相關(guān)度，并建立了木瓜蛋白酶在該體系中的分配模型，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

木瓜蛋白酶（BR），生工生物（上海）股份有限公司；[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4，純度高于99%，上海成捷化學(xué)有限公司；NaH2PO4（分析純）、NaOH（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；其他都為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1901 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通 用有限責(zé)任公司；DK-98-1 型恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；2WAJ 型阿貝折射儀，上海光學(xué)儀器一廠；HJ-5 型多功能恒溫?cái)嚢杵?，常州華奧儀器制造有限 公司。

1.3 方法

1.3.1 相圖的測(cè)定 在298.15 K 的恒溫條件下，利用濁點(diǎn)法測(cè)定雙節(jié)線，制作相圖。分別取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4溶液放在50 ml 小燒杯中，逐滴向小燒杯中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的NaH2PO4溶液，并不斷用磁力攪拌器攪拌，直至出現(xiàn)渾濁點(diǎn)，即為兩相區(qū)。通過稱量計(jì)算出離子液體溶液和鹽溶液在渾濁點(diǎn)時(shí)刻的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。向已渾濁的溶液中逐滴滴加去離子水，直至溶液變澄清為止，即為單相區(qū)。稱量后，再次向小燒杯中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的NaH2PO4溶液，直至出現(xiàn)下一個(gè)渾濁點(diǎn)為止。重復(fù)上述操作。

1.3.2 離子液體雙水相相平衡的測(cè)定 以相圖為指導(dǎo)，選取適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)配制離子液體雙水相體系。分別稱量不同質(zhì)量的離子液體溶液和NaH2PO4固體加入5.0 ml 刻度管中，加去離子水補(bǔ)至5.0 ml，在恒溫振蕩器中振蕩20 min，并在25℃的環(huán)境中放置3.0 h，使體系達(dá)到平衡，溶液完全分相。上、下相離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以用折射率[18]確定，NaH2PO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以用酸堿中和滴定法[19]確定。

離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)wil、折射率n、NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)ws三者的關(guān)系如下

方程參數(shù)見表1。

表1 [Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相方程式(1)參數(shù)Table 1 Parameters of Eq.(1) for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

1.3.3 離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶 以相圖為指導(dǎo)，選取適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)配制雙水相體系。分別稱量不同質(zhì)量的離子液體溶液和NaH2PO4固體加入5.0 ml刻度管中，木瓜蛋白酶的添加量為1.0 mg·ml-1（木瓜蛋白酶的質(zhì)量/體系體積），加去離子水補(bǔ)至5.0 ml，體系pH 7.0，恒溫振蕩20 min，25℃的環(huán)境下靜置3.0 h，使體系分相完全。各吸取上、下相液1.0 ml，稀釋1.0×104倍，備用。轉(zhuǎn)移1.0 ml 待測(cè)液于試管中，加入5.0 ml 考馬斯亮藍(lán)染色液，充分振蕩使之混勻，以不加酶溶液做空白，在595 nm（離子液體在該波長(zhǎng)下沒有吸收峰）下測(cè)定該液的吸光值A(chǔ)并計(jì)算出木瓜蛋白酶的蛋白含量[20]。通過比較實(shí)驗(yàn)可知，由于木瓜蛋白酶添加量較少，對(duì)折射率影響不大，相對(duì)誤差在0.2%以內(nèi)，因此利用1.3.2 的方法測(cè)定上、下相中各組分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙節(jié)線數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，制作相圖

通過Merchuk 方程對(duì)雙節(jié)線實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，制作相圖。

式中，a、b、c為方程參數(shù)。

Merchuk 方程形式簡(jiǎn)潔，近年來主要用于離子液體-鹽和聚合物-鹽雙節(jié)線數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)，效果很好。相關(guān)系數(shù)（R2）、標(biāo)準(zhǔn)偏差（sda）和方程參數(shù)見表2。三角相圖如圖1所示。

表2 298.15 K時(shí)[Cnmim]BF4-NaH2PO4體系雙節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)結(jié)果Table 2 Correlation results of solubility for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 system at 298.15 K

2.2 利用Othmer-Tobias和Bancroft方程對(duì)離子液體雙水相液液平衡數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)

Othmer-Tobias 和Bancrof 經(jīng)驗(yàn)關(guān)聯(lián)方程[21]的表達(dá)式如下

圖1 298.15 K 溫度下[Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相體系 三角相圖Fig.1 Triangular phase diagram for [Cnmim]BF4-NaH2PO4system at 298.15 K

式中，K、n、K′、n′為方程參數(shù)，見表3；代表上相離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)；代表下相NaH2PO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)；wwb代表下相水質(zhì)量分?jǐn)?shù)；代表上相水質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

由表3可知，Othmer-Tobias 和Bancroft 方程很好地關(guān)聯(lián)了離子液體雙水相液液相平衡的數(shù)據(jù)，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均可達(dá)到0.994 以上。作圖2、圖3。通過回歸方程已知下相各組分含量和回歸方程參數(shù)，可以得到上相各組分含量，[C2mim]BF4、[C4mim]BF4、[C6mim]BF4的平均相對(duì)誤差分別為-4.51×10-7%、1.01×10-6%、-2×10-6%，NaH2PO4的平均相對(duì)誤差分別為0.014%、-0.072%、0.019%。方程的擬合結(jié)果很好，見表4。

表3 [Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相方程式(3)和 式(4)中的參數(shù)Table 3 Parameters of Eqs.(3) and (4) for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

圖2 Othmer-Tobias 方程的線性相關(guān)性Fig.2 Linear dependency of Othmer-Tobias equation

圖3 Bancroft 方程的相關(guān)性Fig.3 Linear dependency of Bancroft equation

2.3 模型

離子液體雙水相中木瓜蛋白酶分配系數(shù)K定義為雙水相體系中上相的木瓜蛋白酶蛋白濃度（Ct）與下相的木瓜蛋白酶蛋白濃度（Cb）的比值，公式如下

表4 298.15 K 時(shí)[Cnmim]BF4-NaH2PO4 雙水相液液相平衡擬合結(jié)果Table 4 Result of liquid-liquid equilibria for [Cnmim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system at 298.15 K/% (mass)

表5 分配系數(shù)與雙水相體系組分濃度的相關(guān)性Table 5 Correlation between partition coefficient and difference in concentration of aqueous two-phase system

表6 模型參數(shù)和分配系數(shù)預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)偏差Table 6 Parameters for models calculated average relative deviations between predicted and experimental partition coefficient

變量x和y之間的相關(guān)性定義為η

式中，和是變量的平均數(shù)。分配系數(shù)和參數(shù)的相關(guān)性見表5。從表5可以得到：上相離子液體濃度與lnK的相關(guān)性均高于鹽和水，接近1；下相鹽濃度與lnK具有較好的相關(guān)性。故將上相離子液體濃度和下相鹽濃度與該體系的lnK值進(jìn)行關(guān)聯(lián)，得到的公式如下

式中，A、B、C為方程參數(shù)，方程與謝紅國模型[22]相似，各參數(shù)見表6。

用上述模型擬合了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4- NaH2PO4體系中的蛋白濃度分配系數(shù)和各組分的濃度。由表6可知相對(duì)偏差均小于5%，本工作模型與謝紅國模型相比相對(duì)偏差較小。圖4～圖6關(guān)聯(lián)了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4體系中的蛋白濃度分配系數(shù)和各組分濃度，結(jié)果令人滿意。相對(duì)偏差和關(guān)聯(lián)程度表明本工作模型的建立較其他模型有了較大的改善。

3 結(jié) 論

在298.15 K 的恒溫條件下：

圖4 [C2mim]BF4-NaH2PO4 雙水相中木瓜蛋白酶分配系數(shù)預(yù)測(cè)值Fig.4 Prediction of papain partition coefficient for [C2mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

圖5 [C4mim]BF4-NaH2PO4 雙水相中木瓜蛋白酶分配 系數(shù)預(yù)測(cè)值Fig.5 Prediction of papain partition coefficient for [C4mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

圖6 [C6mim]BF4-NaH2PO4 雙水相中木瓜蛋白酶分配 系數(shù)預(yù)測(cè)值Fig.6 Prediction of papain partition coefficient for [C6mim]BF4-NaH2PO4 aqueous two-phase system

（1）利用濁點(diǎn)法測(cè)定雙節(jié)線，制作相圖，并用非線性Merchuk 參數(shù)方程關(guān)聯(lián)雙節(jié)線數(shù)據(jù)，擬合度均在0.975 以上，結(jié)果令人滿意；

（2）測(cè)定了 [Cnmim]BF4-NaH2PO4雙水相體系的液液相平衡數(shù)據(jù)，并用Othmer-Tobias 和Bancroft方程關(guān)聯(lián)了該數(shù)據(jù)，線性相關(guān)系數(shù)在0.994 以上，平均相對(duì)誤差在0.1%以下，結(jié)果理想；

（3）測(cè)定了木瓜蛋白酶在[Cnmim]BF4-NaH2PO4雙水相體系中的蛋白濃度分配系數(shù)，通過Matlab 建立了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⑦M(jìn)行了關(guān)聯(lián)，相對(duì)偏差在5%以內(nèi)，與其他模型相比關(guān)聯(lián)很理想。

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