方麗娜，陳宇，劉婭，吳可荊，吳玉龍，楊明德

（1石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003；2清華大學核能與新能源技術研究院，北京 100084）

引 言

近年來，隨著化石能源的日趨枯竭和使用化石資源所造成的環(huán)境污染問題，開發(fā)新的可再生能源已經(jīng)成為不可回避的主題。在眾多可再生能源中，生物質(zhì)能因具有清潔無污染、儲量豐富等顯著優(yōu)勢而廣受關注[1]。其中，微藻由于具有光合作用強、生長周期短、不占用耕地面積、環(huán)境適應能力強等優(yōu)勢，成為研究的熱點[2-3]。在微藻眾多轉(zhuǎn)化方法中，以亞/超臨界水作為反應介質(zhì)的水熱液化法可以有效轉(zhuǎn)化微藻中的主要生化組分[4]，無須對原料進行干燥，降低了過程的能耗，該方法已成為微藻能源化利用中最具有潛力的方法之一[5]。

微藻水熱液化所得生物油的組成復雜，當前對生物油組分的分析主要以GC-MS為主，存在很大的局限；為了拓展其應用領域以及進一步揭示液化機理，有必要對其組成信息進行更詳盡的了解。鑒于此，分離純化成為深入剖析生物油組分的一種行之有效的方法[6]。迄今為止，用于生物油分離純化所采用的技術主要包括蒸餾[7]、溶劑萃取[6,8]、超臨界萃取[9-10]和柱層析[11-14]等技術。蒸餾法只能使不同程度的餾分富集，無法進一步得到單一的化學品[7]；溶劑分離雖簡單、快速，但是萃取劑與被萃取組分的分離較難，這一缺點限制了溶劑萃取在生物油分離上的應用[6]；超臨界CO2萃取目前在生物油的分離方面應用較少，存在成本高、投資大的缺點[9]。柱層析是一種重要的分離純化技術。柱層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個層析過程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過程[15]。由于其具有分離量大、載樣品多、操作方便、設備簡單、能在單位時間內(nèi)獲得較多量分離組分等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應用在有機合成與天然產(chǎn)物的分離純化等方面，例如蝦青素、茶多酚等生物活性組分的分離純化[16-17]。工業(yè)上柱層析已經(jīng)廣泛應用于中草藥有效成分的分離提純、高純物質(zhì)制備、石油制品的精制以及有機物質(zhì)的脫水精制[10]。

目前，柱層析法分離純化生物油也已經(jīng)得到了認可。張素萍等[18]應用柱層析法將木屑快速裂解油分離成3種組分：正庚烷淋洗得到脂肪烴，苯淋洗得到芳香烴，甲醇淋洗得到極性組分。李世光等[19]利用柱層析法對杏核和玉米芯快速熱解油進行分離，也得出3個餾分：環(huán)己烷洗脫的芳香化合物，苯洗脫的單環(huán)酚類化合物，甲醇洗脫的極性化合物。Onay等[10]利用柱層析法將堅果殼熱解生物油以正己烷、甲苯和二氯甲烷/甲醇(1:1，體積)為淋洗劑，硅膠為固定相，從生物油中分離出脂肪族、芳香族和極性物質(zhì)等。Wang等[14]則采用柱層析法對木焦油原液組分柱層析分離效果進行了考察，以層析硅膠為柱填料，比較了不同洗脫系統(tǒng)（環(huán)己烷-苯-甲醇溶劑體系和環(huán)己烷-二氯甲烷-甲醇溶劑體系）對組分的分離效果，研究結果表明柱層析對于分離木焦油具有非常好的效果。所含組分提供更全面的信息。上述研究成果主要是針對木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)熱解所得生物油。而有關藻類生物油的分離純化尚未見報道。眾所周知，藻類生物質(zhì)的生化組分與木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)存在很大的差異，其液化產(chǎn)物也不盡相同。因此，很有必要對藻類液化產(chǎn)物進行分離純化，為藻類生物油組分分布提供更全面的信息。此外，為了取得較好的分離效果，選用萃取-柱層析結合的方法來分析生物油。Oasmaa等[20]對生物油萃取分析，先用正己烷萃取，分為正己烷溶解組分和不溶組分，將正己烷不溶組分用蒸餾水分餾，溶于水的部分用二乙醚萃取，不溶于水的部分用二氯甲烷萃取，可以得到較多的生物油組分信息。徐紹平等[21]將杏核熱解油經(jīng)過萃取-柱層析分離得到瀝青烯、酸性組分、環(huán)己烷洗脫餾分、苯洗脫餾分、甲醇洗脫餾分和酚類化合物。通過FT-IR和GC-MS等手段對這幾種餾分分析發(fā)現(xiàn)，萃取-柱層析相結合能很好地將生物油分離。

鑒于此，本文擬通過柱層析的方法對杜氏鹽藻水熱液化生物油進行分離純化。先對液化生物油采用正己烷、二氯甲烷和乙醚進行溶劑分割，然后將二氯甲烷相進行柱層析分析，所得產(chǎn)物采用二次質(zhì)譜和FT-IR進行分析，正己烷相和乙醚相通過GC-MS和FT-IR分析。有望拓展藻類生物油的應用領域，也為藻類進一步資源化利用提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

本實驗所用的原料為西安微藻生物技術有限公司提供的杜氏鹽藻（組分及成分分析如表1所示），曬干后將其研磨粉碎，過0.18～0.25 mm Tyler標準篩后制成樣品。使用前將藻渣放入烘箱中于 105℃下干燥12 h，然后置于干燥箱備用；采用的化學試劑由北京化工廠提供，石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇規(guī)格均為分析純，柱層析用硅膠以及薄層層析用硅膠均由青島海洋化工廠提供。

表1 杜氏鹽藻分析結果 Table 1 Analysis results of D.tertiolecta

圖1 杜氏鹽藻水熱液化實驗流程 Fig.1 Procedure for separation of reaction products

1.2 生物油的制備

生物油按文獻[22]所報道的方法制備，具體步驟如下：按料液比（質(zhì)量比）1:10準確稱取一定量的杜氏鹽藻粉和蒸餾水，將兩者放于燒杯中用玻璃棒攪拌均勻，加入反應釜內(nèi)（美國Parr反應釜），密封。設置反應溫度360℃，攪拌速度為300 r·min-1，當溫度達到反應所需溫度后，保持30 min，反應結束后，停止加熱，反應釜自然冷卻至室溫。反應產(chǎn)物的分離純化流程依據(jù)文獻[20]的流程進行，具體步驟如下：反應釜冷卻后，氣體直接排空，反應釜壁和管路先用正己烷洗滌3次，靜置分離后，減壓蒸餾溶劑得到正己烷相；反應釜壁和管路再用二氯甲烷清洗，并與正己烷不溶相混合，靜置分離出有機相后，減壓蒸餾得到二氯甲烷相；剩余液經(jīng)抽濾后濾液再經(jīng)乙醚反萃取3次，合并后蒸出溶劑得到乙醚相；濾渣置于105℃的烘箱中干燥24 h，得到固體殘渣（如圖1所示）。

1.3 柱層析精制生物油

本實驗采用濕法填柱（層析柱直徑3.5 cm，長1 m，如圖2所示），固定相為柱層析硅膠，將1.2中制備得到的二氯甲烷相裝入層析柱中，采用手動加壓，依序添加洗脫劑進行洗脫，洗脫速度為2～3滴·s-1，用錐形瓶收集洗脫液，每15 ml更換一次錐形瓶；收集的樣品進行薄層層析檢測[石油醚:乙醇=5:1（體積比，下同）作為展開劑]，取比移值（Rf）相同的組分合并、蒸發(fā)濃縮，得到分離產(chǎn)物，保存待分析。

圖2 柱層析裝置 Fig.2 Equipment of column chromatography

1.4 產(chǎn)物分析

產(chǎn)物的紅外光譜分析在Nicolet 670 FT-IR紅外光譜儀上進行，采用液膜法進行測定，掃描范圍400～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32，保存譜圖。GC-MS分析是在DSQ氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國Thermo Electron Corporation公司）上進行的。色譜柱為AB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氦；流速為1 ml·min-1；進樣量為4 μl；分流比為50:1；電離方式為EI；電子能量為70 eV；源溫為250℃；掃描速率為1000 amu·s-1；掃描范圍為35～650 amu；氣化溫度為300℃；GC-MS接口溫度為250℃；GC升溫程序為初始溫度70℃，以10℃·min-1升至300℃，恒溫10 min。MS條件：電離方式為EI；電子能量為70 eV。

1.5 生物油回收率的計算

式中，M1為加入柱層析前粗生物油的質(zhì)量；M2為通過柱層析回收生物油的質(zhì)量。

2 結果與討論

2.1 二氯甲烷相柱層析分離純化

二氯甲烷本身極性非常大，能夠溶解眾多有機化合物，在萃取微藻液化生物油的過程中，可以將大部分的有機物萃取出來，其中包括一些高沸點的大分子。但是，目前對于生物油的產(chǎn)品組成分析均是基于GC-MS結果，而GC-MS分析只能檢測到能夠通過GC柱的物質(zhì)，因此，二氯甲烷相中的高沸點物質(zhì)難以從GC-MS分析得到其組分的信息。這對于全面掌握生物油中的組分信息具有很大的局限性，也大大限制了生物油的進一步精制和其實際應用，因此，十分有必要對其分離純化來深入剖析生物油中的組分信息。為了提高分離純化的效率和減少柱層析的工序，本文先對藻類水熱液化生物油采用正己烷、二氯甲烷和乙醚進行溶劑分割，正己烷相和乙醚相的組分信息可由GC-MS分析直接得到；二氯甲烷相則先經(jīng)柱層析后，再對分離所得組分進行分析。

洗脫劑的洗脫作用是吸附的逆過程，所選擇的洗脫劑必須可以溶解各個組分，但不會與各個組分形成競爭吸附固定相[23]，為了使試樣中不同吸附能力的各個組分能夠很好分離，必須根據(jù)試樣的溶解度、固定相的活性以及洗脫劑的傳質(zhì)速率的快慢選擇適當?shù)南疵搫┳髁鲃酉噙M行洗脫。一般展開劑決定了洗脫劑的種類，通常以待分離樣品Rf值為0.2～0.5最合適。由于分離組分的復雜性，經(jīng)常選擇的洗脫劑是混合溶劑[24]。首先通過薄層層析進行預實驗，分別選用石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮、石油醚/乙醇、石油醚/甲醇4組混合溶劑按照不同體積比作為展開劑，實驗結果表明：混合溶劑（石油醚:乙醇=5:1）作為展開劑時分離效果最好。

柱層析過程中，根據(jù)洗脫過程采用梯度洗脫的方式，洗脫劑所選用的溶劑分別為石油醚、石油醚:乙酸乙酯=10:1、石油醚:乙酸乙酯=5:1、石油醚:乙酸乙酯=2:1、石油醚:乙酸乙酯=1:1、石油醚:丙酮=2:1、石油醚:丙酮=1:1、石油醚:甲醇=5:1、石油醚:甲醇=2:1、石油醚:甲醇=1:1以及甲醇，整個實驗過程中根據(jù)極性的順序依次加入。整個柱層析過程共洗脫分離出16個餾分，根據(jù)洗脫劑中溶劑的種類不同，分別對其進行命名如下：石油醚洗脫餾分（A1-1）；石油醚:乙酸乙酯洗脫的餾分（A2-1，A2-2，A2-3，A2-4，A2-5，A2-6和A2-7）；石油醚:丙酮洗脫的餾分（A3-1，A3-2和A3-3）；石油醚:甲醇洗脫餾分（A4-1，A4-2，A4-3和A4-4）；甲醇洗脫餾分（A5-1）。

經(jīng)過柱層析精制后二氯甲烷相生物油的回收率為91.38%。硅膠柱層析法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上結合力的不同而得到分離，一般情況下極性大的物質(zhì)易于與硅膠上的羥基發(fā)生結合，從而吸附在硅膠上，極性較弱的物質(zhì)則不易被硅膠吸附，整個層析過程即是自由沉降和吸附、解吸、再吸附、再解吸等幾個過程的組合[15]。在整個柱層析對生物油產(chǎn)物進行分離精制的過程中，極性小的物質(zhì)與硅膠的結合力較小，因此優(yōu)先被洗脫出來，而酸和酯類物質(zhì)等極性大的物質(zhì)由于與層析柱中的硅膠結合力較大，最終隨著洗脫劑極性的增大而被逐步洗脫下來。藻類液化生物油中存在一些瀝青質(zhì)和不溶雜質(zhì)等，同時在分離精制后對收集到產(chǎn)物的后處理過程中也會出現(xiàn)一些損耗，所以本文經(jīng)柱層析分離后得到生物油的回收率為91.38%。

2.2 正己烷相和乙醚相的紅外譜圖分析及GC-MS分析

通過GC-MS分析對正己烷相和乙醚相的有機化合物組成進行鑒定，其判定依據(jù)是NIST 98光譜譜圖庫比對。表2和表3分別列出了正己烷相和乙醚相的GC-MS結果，其中，組分統(tǒng)計結果列于圖3中。

表2 正己烷相的GC-MS分析結果 Table 2 GC-MS analysis results for n-hexane soluble fraction

表3 乙醚相的GC-MS分析結果 Table 3 GC-MS analysis results for diethyl ether soluble fraction

圖3 正己烷相與乙醚相組分統(tǒng)計 Fig.3 Chart of component of n-hexane soluble and diethyl ether soluble

圖4 正己烷相和乙醚相的紅外譜圖 Fig.4 FT-IR spectroscopy analysis of n-hexane soluble and diethyl ether soluble

由表2和表3以及圖3中的物質(zhì)和相對含量可以看出，正己烷相中的產(chǎn)物主要以烴類、苯環(huán)以及少量長鏈羧酸等極性較小的物質(zhì)為主，這主要是因為正己烷本身的極性很小，根據(jù)相似相溶原理，正己烷相中的物質(zhì)主要以低極性的物質(zhì)為主。而乙醚相中的產(chǎn)物則以醛酮和含氮類物質(zhì)為主，這是因為乙醚與含雜原子的化合物具有較高的溶解度，所以含雜原子的物質(zhì)特別是含氮類化合物大多出現(xiàn)在乙醚相中。

圖4為正己烷相和乙醚相的紅外光譜圖，從圖中可以看出，在2850～3050 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰為C H鍵的伸縮振動吸收峰，正己烷相中顯示出較強的吸收峰，說明正己烷相中的烴類的含量較多，而1650 cm-1附近的強吸收峰為C N鍵的伸縮振動吸收峰，主要由含氮化合物貢獻，乙醚相中該處吸收峰非常強，說明乙醚相中的含氮化合物含量較高。1700 cm-1附近的強吸收峰為C O鍵的伸縮振動吸收峰，正己烷相中此處吸收峰非常強，這可能與其中含有大量羧酸相關。正己烷相中所含有的酸類物質(zhì)明顯高于乙醚相中，但是乙醚相中最豐富的物質(zhì)是酰胺類物質(zhì)（圖3所示）。由此可以看出，正己烷相和乙醚相的紅外光譜圖與GC-MS結果基本吻合。正己烷相和乙醚相所得物質(zhì)組成大部分都存在于文獻報道[3,22]，這些物質(zhì)能夠直接被GC-MS檢測到，而在柱層析之前通過溶劑分割，可以減少柱層析的過程和工序，提升整個分離純化的效率。

2.3 柱層析產(chǎn)物的紅外分析

二氯甲烷相和柱層析分離所得組分的紅外分析結果如圖5所示。由圖5（a）可以看出，二氯甲烷的紅外光譜結果與文獻報道基本相似[3,22]，其中，紅外光譜圖在3200 cm-1附近有很強的O H伸縮振動峰，根據(jù)有機物紅外光譜范圍與官能團之間的關系可以推測油中存在含羥基的化合物或氨基化合物。烷烴官能團C H在2850 cm-1和2960 cm-1附近有強烈振動峰，在1700 cm-1處有C O伸縮振動峰，表明存在酮和醛類化合物。在1450 cm-1和1370 cm-1處有較強的C H彎曲振動峰，說明存在脂肪類化合物。從其他吸收峰還可以看出，油中有醇、酚、醚、酯及芳香烴類物質(zhì)的存在。

圖5（b）為石油醚洗脫餾分（A1-1）的紅外光譜圖，從圖中可以看出，在2850 cm-1和2960 cm-1附近有強烈振動峰為C H鍵的伸縮振動吸收峰，在1450 cm-1和1370 cm-1處有較強的C H彎曲振動峰，在1600 cm-1附近有較弱的吸收峰，可能是C C鍵伸縮振動吸收峰，由此可以推斷該組分可能為烯烴類物質(zhì)。

圖5（c）為石油醚:乙酸乙酯洗脫的餾分（A2-1，A2-2，A2-3，A2-4，A2-5，A2-6和A2-7）的紅外光譜圖，從圖中可以看出，A2-1和A2-2的紅外曲線與A1-1的紅外光譜圖較為相似，其組分可能為烴類物質(zhì)；A2-3，A2-4，A2-5，A2-6和A2-7的紅外曲線均在1700 cm-1處有C O伸縮振動峰，且在3400～3600 cm-1范圍內(nèi)有振動吸收峰，說明存在 OH官能團，此外，在2850 cm-1和2960 cm-1附近有強烈振動峰為C H鍵的伸縮振動吸收峰，由此可以推斷A2-3，A2-4，A2-5，A2-6和A2-7可能為脂肪酸類化合物。

圖5（d）為石油醚:丙酮洗脫的餾分（A3-1，A3-2和A3-3）的紅外光譜圖，從圖中可以看出，A3-1，A3-2和A3-3的紅外曲線均在1700 cm-1處有C O伸縮振動峰，且在3700 cm-1范圍內(nèi)有振動吸收峰，說明存在 NH2官能團，由此推斷可能為酰胺類 物質(zhì)。

圖5 二氯甲烷相及分離出的各個組分紅外光譜圖 Fig.5 FT-IR spectroscopy analysis of dichloromethane soluble and fraction of separated

圖5（e）為石油醚:甲醇洗脫餾分（A4-1，A4-2，A4-3和A4-4）的紅外光譜圖，從圖中可以看出，A4-3的紅外曲線均在1700 cm-1處有C O伸縮振動峰，且在3400～3600 cm-1范圍內(nèi)有振動吸收峰，說明存在 OH官能團，此外，在2850 cm-1和2960 cm-1附近有強烈振動峰為C H鍵的伸縮振動吸收峰，由此可以推斷其可能為脂肪酸類化合物；其他組分在2850 cm-1和2960 cm-1附近有強烈振動峰為C H鍵的伸縮振動吸收峰，在1450 cm-1和1370 cm-1處有較強的C H彎曲振動峰，由此可以推斷該組分可能為烴類物質(zhì)。

圖5（f）為甲醇洗脫餾分（A5-1）的紅外光譜圖，從圖中可以看出，在2850 cm-1和2960 cm-1附近有強烈振動峰為C H鍵的伸縮振動吸收峰，且在3400～3600 cm-1范圍內(nèi)有振動吸收峰，說明存在 OH官能團，1700 cm-1處有C O伸縮振動峰，可能為羧酸或者羧酸衍生物；此外，該組分的紅外光譜在1000 cm-1為C Cl的伸縮振動吸收峰，可能含有少量二氯甲烷。

圖5（b）～（f）中各組分的紅外譜圖疊加起來與圖5（a）的二氯甲烷相基本吻合，但是經(jīng)柱層析后所得紅外譜圖較為簡單，可以獲得較清晰的紅外振動吸收峰，這說明通過柱層析能獲取純度較高物質(zhì)，而各個組分中的具體物質(zhì)具體組成信息需要結合其他分析手段深入剖析。

2.4 柱層析產(chǎn)物的二次質(zhì)譜分析

二氯甲烷相經(jīng)柱層析分離后所得產(chǎn)物，用GC-MS難以獲得其組分的信息，故對柱層析所得各組分進行了二次質(zhì)譜分析，并結合FT-IR圖來鑒定化合物的組成，所得主要化合物及相對應組分的回收率如表4所示。由表4可以看出，隨著洗脫劑極性的增加，極性大的醇類和酰胺類物質(zhì)被洗脫出來，其中被分離出的物質(zhì)有機酸占了很大的比例，其中硬脂酸、棕櫚酸的含量是最高的，與之對應的洗脫劑是石油醚:乙酸乙酯=5:1。此外，表4中所顯示的物質(zhì)中，硬脂酸、棕櫚酰胺和棕櫚酸已經(jīng)被證實是微藻液化制備生物油的重要組成成分[3,22]，十五烯、十四烷和油酸也應屬于藻類液化生物油的成分之一，但是其他組分卻鮮有報道。由表4可以看出 二氯甲烷相經(jīng)柱層析分離后，可得到16個餾分，分別是石油醚洗脫餾分（A1），主要是烯烴類物質(zhì)；石油醚:乙酸乙酯洗脫的餾分（A2），主要是酸類化合物；石油醚:丙酮洗脫的餾分（A3），主要是含氮的酰胺類物質(zhì)，石油醚:甲醇洗脫餾分（A4），主要是烷烴類物質(zhì)；甲醇洗脫餾分（A5），主要是十八碳烯酰胺。以上組分信息與紅外光譜分析的結論基本吻合。由此可以表明經(jīng)過柱層析可以獲得較多的生物油組分信息，這為以后生物油的精制和實際應用提供了更多的參考依據(jù)，也為進一步剖析藻類液化生物油的液化機理提供了參考。

表4 分離出的各組分的MS結果 Table 4 MS result of fraction of separated from bio-oil

3 結 論

（1）杜氏鹽藻水熱液化所得生物油采用正己烷、二氯甲烷和乙醚進行溶劑分割，其中正己烷相和乙醚相直接通過GC-MS獲取其組分信息。

（2）二氯甲烷相則通過柱層析進行分離純化，分別選取石油醚，石油醚:乙酸乙酯，石油醚:丙酮，石油醚:甲醇和甲醇的混合溶液為洗脫劑，采用梯度洗脫的方式。柱層析產(chǎn)物的回收率達到91.38%，并分離純化得到了16個組分，所得組分的紅外光譜和二次質(zhì)譜分析結果基本吻合，其結果表明柱層析可以獲得較多的生物油組分信息。

（3）本文為生物油的精制和實際應用提供了更多的參考依據(jù)，也為進一步剖析藻類液化生物油的液化機理提供了參考。

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