朱潔，馬茜，王辛，劉翠梅，王愛紅

肌肽對局灶性腦缺血大鼠bcl-2、bax表達(dá)的影響

朱潔，馬茜，王辛，劉翠梅，王愛紅△

目的研究肌肽對局灶性腦缺血大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2（bcl-2）、bcl-2相關(guān)蛋白X （bax）表達(dá)的影響。方法30只SPF級雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和肌肽組，每組10只。模型組和肌肽組以線栓法制作大鼠永久性腦缺血模型，肌肽組于造模后予肌肽水溶液灌胃［1 000 mg/（kg·d）］，其余2組予等量生理鹽水灌胃。分別于造模后清醒時、24 h、72 h通過神經(jīng)功能缺損評分觀察神經(jīng)功能，于72 h采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色觀察腦梗死體積、HE染色觀察病理形態(tài)學(xué)改變，并用免疫組化法檢測bcl-2和bax表達(dá)。結(jié)果肌肽組神經(jīng)功能評分72 h較模型組降低（P＜0.05）；腦組織缺血損傷病理學(xué)改變輕于模型組；腦梗死體積72 h較模型組減?。≒＜0.01）；腦缺血后72 h與假手術(shù)組相比，模型組bcl-2表達(dá)下降、bax表達(dá)上升、bcl-2/bax比值下降（均P＜0.05）；經(jīng)肌肽處理后bcl-2表達(dá)上升、bax表達(dá)下降，bcl-2/bax比值上升（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論肌肽處理能提高bcl-2表達(dá)、降低bax表達(dá)及提高bcl-2/bax比值，這可能是肌肽發(fā)揮神經(jīng)保護作用的分子機制之一。

肌肽；腦缺血；基因，bcl-2；bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；bcl-2/bax

缺血性腦卒中占全腦卒中的85%左右［1］，其中大多由大腦中動脈阻塞引起。腦缺血引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡在遲發(fā)型神經(jīng)元死亡中起重要作用。B淋巴細(xì)胞瘤/白血病-2（bcl-2）和bcl-2相關(guān)蛋白X（bax）在細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)控作用，bcl-2具有抗細(xì)胞凋亡作用，而bax作用相反［2］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)bcl-2和bax調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡不僅取決于自身的表達(dá)水平，還與bcl-2/bax比值有關(guān)［3］。研究表明，肌肽對缺血性腦損傷具有保護作用，且具有劑量依賴性，以1 000 mg/kg劑量效果最佳［4-5］。但研究大多集中于腦缺血后24 h，且大多未觀察肌肽對bcl-2/bax比值的影響。本研究通過制作局灶性腦缺血大鼠模型，觀察肌肽對腦缺血大鼠損傷腦組織bcl-2、bax蛋白表達(dá)和bcl-2/bax比值的影響，探討肌肽的腦保護作用的可能機制，為其治療缺血性腦血管疾病提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組健康雄性SD大鼠30只，SPF級，體質(zhì)量280～320 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供［合格證編號：SCXK（浙）2008-0033］。隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和肌肽組，每組10只。

1.2實驗材料和儀器大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓（北京沙東生物技術(shù)有限公司）；肌肽、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，美國sigma公司）；bcl-2、bax抗體（巴傲得生物技術(shù)有限公司）；ElivisionTMsuper免疫組化試劑盒（福建邁新生物技術(shù)有限公司）；Histostar包埋機、Finesse E+手動切片機（美國Thermo公司）；BX41顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；全自動染色機（英國Shandon公司）；ASP300S全自動真空組織脫水機（德國Leica公司）。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠局灶性腦缺血模型建立本實驗采用線栓法制作大鼠MCAO模型［6］。腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.5 mL/ kg）麻醉。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。假手術(shù)組只分離血管，不插入線栓，其余步驟與模型組相同。

1.3.2治療方法肌肽組予肌肽水溶液灌胃，劑量為1 000 mg/（kg·d），溶劑為生理鹽水［4-5］，每天1次；假手術(shù)組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每天1次；灌胃劑量按照100 g大鼠每天灌胃1 mL計算；首次灌胃時間為造模清醒后2 h以內(nèi)［7］。

1.3.3神經(jīng)功能缺損評分參照Bederson［8］5級4分法評定大鼠神經(jīng)功能缺損。0分：無神經(jīng)功能缺損。1分：輕微缺損，提尾倒懸時不能完全伸展左側(cè)前肢。2分：中度缺損，行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈。3分：重度缺損，向左側(cè)傾倒。4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。評分為0分和4分的大鼠為造模不成功，均被剔除；符合評分但有蛛網(wǎng)膜下腔出血、術(shù)中術(shù)后死亡亦予以剔除，用同一批次的大鼠造模成功后隨機補充，補足數(shù)目保證分組且每組大鼠數(shù)量不變。

1.3.4TTC染色術(shù)后72 h處死大鼠，在冰上迅速取腦，將腦組織放入-20℃冰箱快速冷凍20 min，待組織凍硬后進(jìn)行冠狀切片（片厚2 mm）。將切片放入1%TTC溶液中，37℃避光染色30 min，每隔10 min翻1次，以保證染色均勻。用4%多聚甲醛固定24 h后拍照，計算梗死體積，正常腦組織染色后呈鮮紅色，梗死區(qū)呈蒼白色。計算公式為：用分辨率（固定為118.11像素/cm）的平方除以總像素，得到以/cm2為單位的面積，得出實際面積（A1～A5），切片厚度（t）固定2 mm，代入公式V=t×［0.5×（A1+A5）+A2+A3+A4］。

1.3.5腦組織病理學(xué)檢查術(shù)后72 h各組隨機取4只大鼠，麻醉后仰臥位固定，用預(yù)冷的4%多聚甲醛溶液心臟灌注，然后迅速斷頭取腦，分離大腦皮質(zhì)，切取小塊置于4%多聚甲醛中固定24 h，再脫水透明，石蠟包埋切片，HE染色，光化學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.3.6bcl-2、bax免疫組化染色術(shù)后72 h斷頭取腦，進(jìn)行免疫組化染色，參照ElivisionTMsuper免疫組化試劑盒說明檢測bcl-2和bax的表達(dá)情況。bcl-2和bax表達(dá)以胞漿著色呈棕黃色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。將每張切片于鏡下同一強度隨機讀取右側(cè)皮質(zhì)5個不重疊的400倍視野進(jìn)行攝片，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測量陽性區(qū)域的累積光密度（integrated optical density，IOD）來反映照片中相應(yīng)蛋白表達(dá)的總量。染色陽性程度越高，IOD值越高，所測得值的均值即分別為bcl-2和bax含量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行分析。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩組獨立樣本t檢驗，非正態(tài)計量資料采用中位數(shù)M （P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，模型組和肌肽組均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能損傷；腦缺血后24 h，肌肽組與模型組神經(jīng)功能評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而腦缺血后72 h，肌肽組神經(jīng)功能評分明顯低于模型組（P＜0.05）。見表1。

Tab.1　Comparison of neurological deficit score and infarct volume between three groups表1　各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積的比較

2.2大鼠腦梗死體積比較假手術(shù)組無明顯梗死灶；模型組出現(xiàn)明顯梗死灶；肌肽組腦梗死體積較模型組明顯減?。≒＜0.01）。見表1，圖1。

2.3大鼠損傷腦組織病理觀察假手術(shù)組：大鼠腦實質(zhì)各層結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞未見腫脹、空泡變性，核正常，無核固縮，神經(jīng)細(xì)胞未見壞死，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯的病理性損傷。模型組：大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元重度壞死，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核固縮，胞體縮小變形，間質(zhì)水腫，血管周間隙明顯增寬。肌肽組：大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元輕度變性壞死，神經(jīng)元數(shù)目減少得到改善，細(xì)胞核固縮、胞體縮小變形、間質(zhì)水腫、血管周間隙增寬得到明顯改善。見圖2。

Fig.1　TTC staining of rat brain tissue of three groups圖1　各組大鼠腦組織TTC染色結(jié)果

Fig.2　HE staining of rat brain tissue of three groups圖2　各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果（HE染色，×400）

2.4bcl-2、bax蛋白表達(dá)及bcl-2/bax比較與假手術(shù)組比較，模型組bcl-2陽性表達(dá)明顯降低，bax陽性表達(dá)明顯升高，bcl-2/bax比值明顯降低，肌肽組bcl-2陽性表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，肌肽組bcl-2陽性表達(dá)明顯升高（P＜0.01），bax陽性表達(dá)明顯降低，bcl-2/bax比值明顯升高（P＜0.05）。見表2，圖3、4。

Tab.2　Comparison of the IOD values of bcl-2 and bax protein expression in cortex of rats between three groups表2　各組大鼠皮質(zhì)區(qū)bcl-2及bax蛋白表達(dá)比較（n=4，±s）

Tab.2　Comparison of the IOD values of bcl-2 and bax protein expression in cortex of rats between three groups表2　各組大鼠皮質(zhì)區(qū)bcl-2及bax蛋白表達(dá)比較（n=4，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組肌肽組F bcl-2（IOD）19 846.60±5 443.00 8 009.20±1 881.20a28 417.00±6 901.80a b15.595＊＊bax（IOD）36 087.00±13 281.71 79 254.00±14 175.00a40 024.00±14 428.43b5.751＊bcl-2/bax 0.66±0.38 0.11±0.05a0.81±0.41b5.122＊

3　討論

3.1肌肽可改善腦缺血后繼發(fā)性的腦損傷腦缺血后繼發(fā)性的腦損傷是缺血性腦卒中最終致殘的關(guān)鍵因素，腦組織缺血、缺氧的病理生理改變最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能受損。腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評分是評價腦缺血損傷的金標(biāo)準(zhǔn)［9］。本研究中模型組較假手術(shù)組出現(xiàn)明顯腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙，與有關(guān)報道一致［4-5］。

肌肽是一種由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的水溶性二肽，主要存在于脊椎動物的骨骼肌肉中，在腦組織及心肌中仍能檢測到肌肽［10］。肌肽是目前為止發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)最簡單的生物活性肽之一，具有抗氧化、抗炎、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)等功能［11］。研究表明，肌肽對缺血性腦損傷具有保護作用，且具有劑量依賴性，1 000和2 000 mg/kg肌肽具有腦保護作用，但低劑量（500、750 mg/kg）是否具有腦保護作用尚存在爭議［4-5］，故本研究肌肽劑量選擇1 000 mg/kg。本研究顯示，肌肽可明顯改善神經(jīng)功能缺損、減小腦梗死體積、改善腦組織病理損傷，具有腦保護作用?？紤]原因可能是肌肽具有抗氧化、清除自由基、抗炎等功能［11］。

3.2bcl-2和bax蛋白在腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用近年來研究表明，在腦缺血引起腦組織損傷進(jìn)程中，有許多機制在起作用，如氧化應(yīng)激、酸中毒、興奮性毒性、炎癥、細(xì)胞凋亡等［12］。細(xì)胞凋亡在缺血性腦損傷進(jìn)程中可能起重要作用。bcl-2和bax是bcl-2基因家族中與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的兩種基因。當(dāng)bcl-2表達(dá)增高時，可形成bcl-2-bax異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡；相反，當(dāng)bax表達(dá)增高時，可形成bax/bax同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。bcl-2和bax的比值能反映細(xì)胞受刺激后趨向于凋亡還是存活。當(dāng)bcl-2表達(dá)增加，bax表達(dá)下降，兩者比值增加時，細(xì)胞趨向存活［3］。本研究中模型組bcl-2蛋白表達(dá)及bcl-2/bax比值較假手術(shù)組明顯下降，bax蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯上升，表明腦缺血后細(xì)胞凋亡增加，與有關(guān)報道一致［9，14］。然而，關(guān)于肌肽能否調(diào)節(jié)bcl-2、bax蛋白表達(dá)及bcl-2/bax比值，目前研究不多。

3.3bcl-2、bax蛋白與肌肽腦保護機制的關(guān)系本研究中肌肽組bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組和模型組，bax蛋白表達(dá)低于模型組，bcl-2/bax比值高于模型組，表明肌肽可抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡，這與既往研究結(jié)果也一致［5，15］。其原因可能與肌肽調(diào)節(jié)bcl-2、bax蛋白表達(dá)，進(jìn)而提高bcl-2/bax比值有關(guān)。與Cheng等［15］體外實驗不同，本研究通過在體實驗進(jìn)一步證實前人研究結(jié)果。

綜上所述，肌肽可通過調(diào)節(jié)bcl-2、bax蛋白表達(dá)及bcl-2/bax比值而發(fā)揮腦保護作用，但肌肽發(fā)揮抗凋亡作用最佳干預(yù)時間及持續(xù)時間還需進(jìn)一步探討。

（圖3、4見插頁）

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（2014-08-20收稿2014-10-27修回）

（本文編輯李鵬）

The influence of carnosine in expression levels of bcl-2 and bax after focal cerebral ischemia in rats

ZHU Jie，MA Qian，WANG Xin，LIU Cuimei，WANG Aihong△
Institute of Nursing，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China
△Corresponding AuthorE-mail：wah710630@163.com

ObjectiveTo explore the effect of carnosine in the expression of B cell lymphomal/leukemia-2（bcl-2）and bcl-2-associated X protein（bax）after focal cerebral ischemia in rats.MethodsThirty male SD rats（SPF scale）were randomly divided into 3 groups:sham-operated group，model group and carnosine treated group（n=10 for each group）.The middle cerebral artery occlusion model（MCAO）was induced in model group and carnosine treated group.Rats were received carnosine［1 000 mg/（kg·d），orally］in carnosine treated group，and the other rats were received the same volume of normal saline（NS）in shame-operated group and model group.The neurological deficit score was used to evaluate the neurological function at 24 h and 72 h after MCAO.Morphological changes were observed by HE staining.TCC staining was used to label infarct volume，and immunohistochemistry was used to detect the expression of bcl-2 and bax.ResultsCompared with model group，the score of neurological function and infarct volume were significantly declined in carnosine treated group at 72 h after injury（P＜0.05 or P＜0.01）.The changes of ischemic impairment were lighter in carnosine treated group than that of model group.Compared with sham-operated group，the expression levels of bcl-2 and the ratio of bcl-2/bax were decreased while the expression of bax was increased in model group（P＜0.05）.Compared with model group，carnosine could significantly increase the expression of bcl-2 and the ratio of bcl-2/bax，and reduce the expression of bax（P＜0.01 or P＜0.05）. ConclusionCarnosine can enhance bcl-2 expression，decrease bax expression and increase the ratio of bcl-2/bax，which is likely to be one of the mechanisms of neuroprotection.

carnosine；brain ischemia；genes，bcl-2；bcl-2-associated X protein；bcl-2/bax

R743.33

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.010

江蘇省青藍(lán)工程項目資助、江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項目資助項目（YSHL0201-26）

南京中醫(yī)藥大學(xué)護理學(xué)院（郵編210023）

朱潔（1989），女，碩士在讀，主要從事腦血管疾病的基礎(chǔ)與臨床方面研究

△E-mail：wah710630@163.com