王剛濤，張旭輝，張衛(wèi)東，夏磊

蛻皮甾酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

王剛濤，張旭輝△，張衛(wèi)東，夏磊

目的 探討蛻皮甾酮（EDS）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 體外分離、培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)損傷組（LPS組），蛻皮甾酮干預(yù)組（LPS+EDS組）。MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率及細(xì)胞凋亡率；RT-PCR和Western blot檢測(cè)軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）表達(dá)；硝酸還原酶法和ELISA法分別檢測(cè)各組NO及白細(xì)胞介素（IL）-1β含量。結(jié)果 與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高，iNOS mRNA和蛋白表達(dá)量以及NO和IL-1β含量增高（均P＜0.05）。LPS+EDS組較LPS組細(xì)胞增殖率升高，凋亡率降低，iNOS mRNA和蛋白表達(dá)量及NO和IL-1β的含量降低（均P＜0.05）。結(jié)論蛻皮甾酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與抑制iNOS表達(dá)有關(guān)。

蛻皮甾酮；軟骨細(xì)胞；脂多糖類；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；白細(xì)胞介素1β；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

軟骨損傷是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要因素［1］。目前骨關(guān)節(jié)炎治療多用西藥，療效不明顯且不良反應(yīng)較多，近年來(lái)中藥治療骨關(guān)節(jié)炎因其不良反應(yīng)少而成為研究熱點(diǎn)。蛻皮甾酮（ecdysterone，EDS）是一類植物甾酮，是牛膝等骨關(guān)節(jié)中藥類藥物的重要活性成分。研究表明蛻皮甾酮影響骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展［2］。本研究以蛻皮甾酮為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建軟骨細(xì)胞損傷模型，研究蛻皮甾酮對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制，為骨關(guān)節(jié)炎的合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭兔6只，4周齡，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，購(gòu)自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。EDS和LPS購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、Ⅱ型膠原酶購(gòu)于Gibco公司。AV/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD公司；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；兔白細(xì)胞介素（IL）-1β ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于R&D Systems公司；羊抗兔誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和β-actin一抗、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鼠抗羊二抗購(gòu)自Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 采用耳緣靜脈空氣注射法迅速處死新西蘭兔，無(wú)菌條件下截取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)面軟骨。將軟骨置于含100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的PBS中洗滌3次，眼科剪剪碎至0.5～1.0 mm3的組織塊。將剪碎的軟骨組織置于培養(yǎng)瓶中，加入5 mL 0.25%的胰蛋白酶，5% CO2、37℃消化1 h。移液管吸出胰蛋白酶，加入5 mL 0.2%Ⅱ型膠原酶，振蕩繼續(xù)消化16 h，每6～8 h收集1次細(xì)胞。用200目濾網(wǎng)收集消化完全的軟骨細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗后800 r/min離心10 min再次去除上清。加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，0.25%臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞率大于90%，則進(jìn)行傳代培養(yǎng)。原代軟骨細(xì)胞以1× 105個(gè)/mL接種于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)選取第3代兔軟骨細(xì)胞，以低血清（0.5%）DMEM培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后，加藥干預(yù)。細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、LPS組（10 mg/L LPS）、LPS+EDS組（10 mg/L LPS+100 μmol/L EDS）。LPS和EDS均以不含F(xiàn)BS的DMEM稀釋至所需濃度。分組處理48 h、72 h后進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 各組細(xì)胞以6×104個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥處理后繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，于37℃培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，以490 nm波長(zhǎng)于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值（A490），計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=處理組A490/對(duì)照組A490×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞分組培養(yǎng)48 h后以預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入胰酶消化重懸后，立即加入AnnexinⅤ-FITC （5 mg/L）10 μL和PI 5 μL，振蕩混勻后37℃避光孵育30 min。加入300μL結(jié)合緩沖液混合后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞凋亡率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)iNOS mRNA表達(dá) 培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后PCR擴(kuò)增iNOS。擴(kuò)增條件：95℃2 min；95℃1 min，64℃1 min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。引物序列：iNOS上游5′-CCT TGTTCAGCTACGCCT TC-3′，下游5′-CATGGTGAACACGTTCTTGG-3′；內(nèi)參β-actin上游5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，自動(dòng)凝膠成像分析儀分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以目的基因灰度值/內(nèi)參灰度值表示。

1.2.6 Western blot檢測(cè)iNOS蛋白表達(dá) 培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。以β-actin為內(nèi)參，取120 μg的總蛋白行SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)膜，先后結(jié)合羊抗兔iNOS一抗（1∶1 000）和HRP標(biāo)記的鼠抗羊二抗（1∶100），最后X線片曝光分析，結(jié)果采用Image-Pro Plus分析，以iNOS與內(nèi)參β-actin的灰度值比值作為iNOS的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 NO和IL-1β檢測(cè) 收集待測(cè)兔軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清，NO含量采用硝酸還原酶法，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用半自動(dòng)生化儀測(cè)定。IL-1β含量采用ELISA法，按試劑盒操作說(shuō)明，酶標(biāo)儀測(cè)定A490值。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖率比較 與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞48 h與72 h后細(xì)胞增殖率明顯下降（均P＜0.05）。與LPS組相比，LPS+EDS組細(xì)胞增殖率明顯升高（P＜0.05），LPS+EDS組與對(duì)照組細(xì)胞增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1 Comparison of the cell proliferation among three groups表1 各組細(xì)胞增殖率比較 （n=3，±s）

Tab.1 Comparison of the cell proliferation among three groups表1 各組細(xì)胞增殖率比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組相比，b與LPS組相比，P＜0.05；圖1、表2、3同

組別48 h72 h對(duì)照組0.64±0.030.72±0.03 LPS組0.21±0.05a0.22±0.03aLPS+EDS組0.61±0.02b0.65±0.04bF 250.021＊＊314.257＊＊

2.2 細(xì)胞凋亡率 LPS組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）。與LPS組相比，LPS+EDS組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Comparison of chondrocyte apoptosis among three groups圖1 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.3 iNOS mRNA和蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，LPS 組iNOS mRNA及蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）。經(jīng)EDS干預(yù)后iNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平較LPS組降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2，表2。

Fig.2 Expression of iNOS in all three groups圖2 各組細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)

Tab.2 Comparison of mRNA transcription and protein expression levels of iNOS among three groups表2 各組細(xì)胞iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of mRNA transcription and protein expression levels of iNOS among three groups表2 各組細(xì)胞iNOS mRNA及蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

?

2.4 NO及IL-1β含量比較 與對(duì)照組相比，LPS組NO和IL-1β表達(dá)升高（P＜0.05）。LPS+EDS組與LPS組相比NO和IL-1β水平降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.3 Comparison of NO and IL-1β content in chondrocyte among three groups表3 各組NO和IL-1β含量比較（n=3，±s）

Tab.3 Comparison of NO and IL-1β content in chondrocyte among three groups表3 各組NO和IL-1β含量比較（n=3，±s）

組別NO（μmol/L）IL-1β（μg/L）對(duì)照組12.76±1.2460.58±5.86 LPS組21.87±3.06a143.69±8.67aLPS+EDS組15.23±2.56ab80.65±6.69abF 14.027＊＊135.426＊＊

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是由多種炎癥因子和細(xì)胞因子參與的慢性疾病，其病理過(guò)程以關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變?yōu)橹鳎?］。軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解中具有重要作用［4］。蛻皮甾酮是一類植物雌激素，能夠與哺乳動(dòng)物或人的雌激素受體（ER）相結(jié)合，起到雌激素樣活性效應(yīng)。研究顯示，女性骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高于男性，雌激素水平增高對(duì)軟骨細(xì)胞損傷有保護(hù)作用［5］。LPS作為一種常見(jiàn)的促炎因子多應(yīng)用于各類炎癥的體外研究，如骨關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、氣道損傷等［6-8］。本研究顯示LPS+EDS組軟骨細(xì)胞增殖率較LPS組增高，提示蛻皮甾酮對(duì)損傷的軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。

細(xì)胞因子和炎癥因子在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程中起著重要作用［9］，其中以炎性細(xì)胞因子IL-1β以及炎性介質(zhì)NO尤為顯著［10-11］。IL-1β是促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解以及軟骨破壞的主要因子之一。既往研究表明骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中IL-1β的含量明顯升高［12］。NO能抑制蛋白多糖和膠原蛋白的合成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，并刺激細(xì)胞金屬蛋白酶的啟動(dòng)和產(chǎn)生，以此介導(dǎo)IL-1β等細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［13］。骨關(guān)節(jié)中NO主要由iNOS產(chǎn)生，iNOS已被證實(shí)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的臨床和病理進(jìn)展有促進(jìn)作用［14］。正常的軟骨細(xì)胞受到某些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子（TNF）、IL-1β和LPS等刺激后，iNOS的表達(dá)升高，使NO水平升高，并協(xié)同各種細(xì)胞因子增加軟骨損害［15］。本研究顯示，EDS可抑制LPS誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞iNOS表達(dá)，推測(cè)EDS通過(guò)影響軟骨細(xì)胞中iNOS的表達(dá)水平，抑制NO的產(chǎn)生，減少細(xì)胞因子IL-1β生成，從而對(duì)軟骨細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。本研究證實(shí)蛻皮甾酮對(duì)LPS誘發(fā)兔軟骨細(xì)胞損傷有明顯的抑制作用，且其作用與軟骨細(xì)胞中iNOS調(diào)節(jié)的NO的產(chǎn)生和細(xì)胞因子IL-1β改變相關(guān)。因此，筆者認(rèn)為蛻皮甾酮作為一種類植物雌激素對(duì)臨床防治骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

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（2014-10-11收稿 2015-01-14修回）

（本文編輯 胡小寧）

Protective effect of ecdysterone on rabbits chondrocytes that is injured by lipopolysaccharide

WANG Gangtao，ZHANG Xuhui△，ZHANG Weidong，XIA Lei
Department of Joint surgery，the 371thCenter Hospital of The PLA，Xinxiang 453000，China
△Corresponding Author E-mail:xuhuiz@163.com

Objective To study the effect of ecdysterone（EDS）on rabbits chondrocytes that is injuried by lipopolysaccharide（LPS）.Methods Aricular chondrocytes were isolated from rabbits and randomly divided into three groups:control group；chondrocytes with LPS induced injury（LPS group）；injury chondrocytes treated with EDS（LPS+EDS group）.The cell proliferation and cell apoptosis of chondrocytes were determined by MTT method and flow cytometry assay respectively.The mRNA and protein expression levels of inducible nitric oxide synthase（iNOS）were detected by RT-PCR and western blot.In addition，the content of NO and IL-1β were measured by nitric acid reductase assay and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）respectively.Results Attenuated proliferation，increased cell apoptosis，iNOS，NO and IL-1β were seen in LPS group，but all these changes were significantly reversed by EDS treatment（P＜0.05）.Conclusion Ecdysterone exhibited a protective effect on LPS induced rabbits chondrocytes injury through inhibiting the expression of iNOS.

Ecdysterone；chondrocytes；lipopolysaccharides；cell proliferation；apoptosis；interleukin-1beta；iNOS

R684.3

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.003

解放軍第371中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科（郵編453000）

王剛濤（1978），男，主治醫(yī)師，學(xué)士，主要從事退行性骨關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)鏡和關(guān)節(jié)置換

△E-mail:xuhuiz@163.com