張發(fā)宇，趙冰冰，蔡靜，袁夢媛，盛晶夢，汪家權(quán)*

鹽析法純化新鮮藍藻中藻藍蛋白工藝條件的研究

張發(fā)宇1，趙冰冰1，蔡靜2，袁夢媛1，盛晶夢1，汪家權(quán)1*

1.合肥工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽合肥230009 2.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009

以水華暴發(fā)的新鮮藍藻為處理對象，采取凍融破壁的方式獲取藻藍蛋白的粗提液。在一步鹽析與二步鹽析單因素試驗的基礎(chǔ)上，基于正交試驗綜合考慮鹽析時間、藻藍蛋白的濃度、pH和（NH4）2SO4飽和度對純化藻藍蛋白的影響。結(jié)果表明，一步鹽析中最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為17%、藻藍蛋白粗提液濃度為1.45 g/L、pH為6.4、鹽析時間為15 min；二步鹽析中最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為35%、pH為4.0、鹽析時間為15min。最終能得到純度為2.04的藻藍蛋白，有利于藻藍蛋白的進一步純化。

鹽析；純化；藻藍蛋白；正交試驗

張發(fā)宇，趙冰冰，蔡靜，等.鹽析法純化新鮮藍藻中藻藍蛋白工藝條件的研究［J］.環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報，2015，5（6）：499-503.

ZHANG F Y，ZHAO B B，CAIJ，et al.Research on technology conditions of purifying phycocyanin from fresh algae using salt precipitation［J］.Journal of Environmental Engineering Technology，2015，5（6）：499-503.

富營養(yǎng)化是指由于人類的活動，水體中營養(yǎng)物（一般是氮、磷的化合物）增加，引起浮游植物過量生長和整個水體生態(tài)平衡的改變，因而造成危害的一種污染現(xiàn)象［1］。其結(jié)果是引起水質(zhì)惡化、溶解氧耗竭、透明度降低、漁業(yè)減產(chǎn)、阻塞航道，對人和動物產(chǎn)生毒性等。這種現(xiàn)象在江河湖泊中稱為水華［2］。

湖泊水華的直接表現(xiàn)是浮游植物即藍藻的大面積暴發(fā)。針對藍藻暴發(fā)，一般采取機械和人工的方式進行打撈，但打撈后的藍藻如果處置不當會造成二次污染，因此，針對打撈后的藍藻進行資源化研究具有重要意義。目前，藍藻資源化利用方式主要以產(chǎn)沼氣和肥料為主［3-6］，產(chǎn)品附加值較低，經(jīng)濟效益不高。研究表明，藍藻中含有一種天然色素蛋白——藻藍蛋白；該蛋白具有良好的功效，如抗炎性［7］、抗癌性［8］、抗衰老性［9］、抗氧化性［10-11］、免疫熒光性［12-13］等；該蛋白純度越高價值越大。因此，從藍藻中提取藻藍蛋白，是藍藻高附加值資源化利用的方向，也更符合目前經(jīng)濟社會發(fā)展需求。研究［14］表明，藻藍蛋白純度達到0.7以上，可作為食品級使用；純度達到2以上，可作為藥品級使用；純度達到4以上，可作為試劑級使用?？梢?，從水華暴發(fā)的藍藻中純化藻藍蛋白既能達到消除污染的目的，又可實現(xiàn)高附加值資源化利用。

純化藻藍蛋白的研究較多［15-19］，筆者選擇以反復(fù)凍融破壁的方式獲得藻藍蛋白粗提液，重點研究鹽析法純化藻藍蛋白的基本工藝條件。選取鹽析法純化藻藍蛋白是因為該法具有應(yīng)用成熟、材料來源廣泛、易于工業(yè)化等優(yōu)點。國內(nèi)研究鹽析工藝一般都基于較粗放的不同飽和度（NH4）2SO4的單因素試驗［20］，對運用0.618法精確選取合適（NH4）2SO4飽和度范圍以及兩步鹽析中各因素之間關(guān)系的研究較少。另外，對影響鹽析的各要素之間關(guān)系的研究也很少。因此，筆者在一步和二步鹽析單因素試驗中運用0.618法精確選取合適（NH4）2SO4飽和度范圍的基礎(chǔ)上，建立起兩步鹽析中相關(guān)因素的正交試驗，得到鹽析法純化藻藍蛋白的優(yōu)化條件，并通過鹽析法獲得純度較高的藻藍蛋白，以期為后期進一步的純化提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮藍藻采自巢湖西湖區(qū)水華暴發(fā)表層20 cm水體，含水率為96.2%，采樣日期為2014年8月9日，采樣期間天氣晴朗，室外氣溫37～38℃。藍藻采集后運回實驗室放入冰柜（BC/BD-718DTF型）內(nèi)儲存?zhèn)溆?，存儲溫度?18℃。

硫酸銨（（NH4）2SO4）、硫酸（H2SO4）、氫氧化鈉（NaOH）均為國產(chǎn)分析純試劑，自配濃度為0.002 5 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.2試驗方法

1.2.1提取藻藍蛋白粗提液

取冷凍保存的巢湖新鮮水華藍藻，反復(fù)凍融3次。將解凍后的藍藻于高速冷凍離心機（KDC-160HR型）中離心20 min，上清液過4層普通紗布，即可得到藻藍蛋白粗提液。

1.2.2兩步鹽析及正交試驗

在（NH4）2SO4飽和度為10%～60%范圍內(nèi)，根據(jù)0.618法的原理進行一步鹽析，步驟如下：在已取得的藻藍蛋白粗提液中緩慢加入（NH4）2SO4，用恒溫攪拌器（85-2A型）進行攪拌，以防止溶液局部濃度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。（NH4）2SO4飽和度分別調(diào)至17%、19%、20%、21%、22%、24%、29%和41%，共8組。（NH4）2SO4經(jīng)攪拌溶解后，在4℃、8 00 0 r/min高速冷凍離心機中離心10 min，倒出上清液，用紫外-可見分光光度儀（UV/VIS-1950型）測定藻藍蛋白純度，并計算得率。

在第一步鹽析試驗基礎(chǔ)上，綜合考慮（NH4）2SO4飽和度、藻藍蛋白的初始濃度、pH和鹽析時間的影響，優(yōu)選一步鹽析中因素與水平，建立正交試驗。

同樣，在（NH4）2SO4飽和度為21%～70%范圍內(nèi)，根據(jù)0.618法的原理進行二步鹽析，步驟如下：將藻藍蛋白粗提液在一步鹽析的（NH4）2SO4最優(yōu)飽和度下鹽析后，取適量上清液，向其中追加（NH4）2SO4，至其飽和度分別達到 28.16%、29.28%、29.80%、30.40%、30.92%、32.56%、35.32%、39.72% 和 51.28%，共 9組。加 入（NH4）2SO4后，經(jīng)恒溫攪拌器攪拌溶解，在4℃、8 000 r/min高速冷凍離心機中離心10 min，獲得沉淀，沉淀用磷酸緩沖溶液（0.002 5 mol/L的PBS）溶解后，用紫外-可見分光光度儀測定藻藍蛋白純度，并計算得率。

在二步鹽析試驗基礎(chǔ)上，綜合考慮（NH4）2SO4飽和度、pH和鹽析時間的影響，優(yōu)選二步鹽析中因素與水平，建立正交試驗。

1.3分析方法

藻藍蛋白在620 nm處有特征吸收峰，蛋白在280 nm處有最大吸收峰，藻藍蛋白的純度測量參考A.Herrera等［21］推薦的公式。藻藍蛋白濃度、得率參考B.Soni等［22］推薦的公式。

藻藍蛋白純度（P）=A620/A280

藻藍蛋白濃度（C）=（A620-0.7×A650）/7.38

藻藍蛋白得率=（C×V×k1）/（m×k2×1 000）×100

式中：A280、A620、A650分別為波長280、620和650 nm處的吸光度；C為蛋白濃度，g/L；V為藻藍蛋白體積；m為藻泥質(zhì)量；k1為藻藍蛋白稀釋倍數(shù)；k2為藻泥中藍藻干物質(zhì)所占比例。

2　結(jié)果與討論

2.1一步鹽析（NH4）2SO4飽和度單因素試驗

將1.2.1節(jié)中所取得的藻藍蛋白粗提液（初始純度為0.426），在室溫（25℃）下，按1.2.2節(jié)步驟并依據(jù)0.618法選點原理進行試驗，在（NH4）2SO4飽和度為17%、19%、20%、21%、22%、24%、29%、41%下，分別測定上清液中藻藍蛋白純度和得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1　一步鹽析（NH4）2SO4飽和度對藻藍蛋白純度與得率的影響Fig.1　Effect of different（NH4）2SO4saturation on phycocyanin purity and yield of the first salt precipitation（25℃）

由圖1可見，在（NH4）2SO4飽和度為21%時，藻藍蛋白純度達到最大，為0.519。在（NH4）2SO4飽和度為17%～24%時，得率變化不明顯。但當（NH4）2SO4飽和度大于29%后，純度與得率均有較大程度下降。因此，一步鹽析中選?。∟H4）2SO4飽和度最優(yōu)點為21%，一步鹽析（NH4）2SO4飽和度為17%～24%較合適。

2.2一步鹽析正交試驗

在一步鹽析（NH4）2SO4飽和度單因素試驗的基礎(chǔ)上，綜合考慮（NH4）2SO4飽和度、藻藍蛋白濃度、pH和鹽析時間的影響，按照L9（43）建立正交試驗。影響因素及水平見表1。將正交試驗的極差分析結(jié)果見表2。

表1　一步鹽析正交試驗影響因素及水平Table1　Factors and levels of orthogonal experimentof the first salt precipitation

表2　一步鹽析正交試驗極差分析結(jié)果Table 2　Results of orthogonal experiment of the first salt precipitation

由表2可知，各影響因素對純度的重要性依次為pH＞鹽析時間＞（NH4）2SO4飽和度＞藻藍蛋白濃度。pH影響最大，酸性和堿性環(huán)境對一步鹽析中藻藍蛋白的純化均有影響，在一定程度上會導(dǎo)致上清液中藻藍蛋白純度下降，原水環(huán)境（pH=6.4）是一步鹽析純化藻藍蛋白最優(yōu)環(huán)境。在（NH4）2SO4飽和度為17%～25%時，鹽析時間、（NH4）2SO4飽和度影響較弱，如果（NH4）2SO4飽和度較高，鹽析時間可減少，也會有良好的純化效果。藻藍蛋白濃度影響最弱，在低濃度的藻藍蛋白溶液下，基本上可以不考慮其濃度變化的影響。綜合表2可知，在室溫（25℃）下，一步鹽析最優(yōu)的工藝條件：（NH4）2SO4飽和度為17%，藻藍蛋白濃度為1.45 g/L，pH為6.4（即原水pH），鹽析時間為15 min。

2.3二步鹽析（NH4）2SO4飽和度單因素試驗

根據(jù)一步鹽析試驗結(jié)果，在室溫25℃下，精細追加（NH4）2SO4，至其飽和度分別為 28.16%、29.28%、29.80%、30.40%、30.92%、32.56%、35.32%、39.72%和51.28%，得到的藻藍蛋白沉淀經(jīng)溶解后測藻藍蛋白純度和得率見圖2。

圖2　二步鹽析不同飽和度（NH4）2SO4對藻藍蛋白純度與得率的影響Fig.2　Effect of different（NH4）2SO4saturation on phycocyanin purity and yield of the second salt precipitation

由圖2可見，二步鹽析時，當（NH4）2SO4飽和度為28.16%～29.80%，沉淀中藻藍蛋白的純度和得率均呈上升趨勢，在（NH4）2SO4飽和度為29.80%時，沉淀中藻藍蛋白的純度和得率分別達到最大值，為1.969和2.95%。當（NH4）2SO4飽和度大于29.80%時，純度開始下降，當（NH4）2SO4飽和度大于30.92%時，純度下降開始明顯，但得率變化并不明顯。因此，二步鹽析中選取（NH4）2SO4的飽和度最優(yōu)值為 29.80%，（NH4）2SO4飽和度為29.28%～35.32%較合適。

2.4二步鹽析正交試驗

在第二步鹽析單因素試驗與一步鹽析正交試驗的基礎(chǔ)上，進行二步鹽析的正交試驗。考慮到藻藍蛋白濃度影響最小，并且在實際中調(diào)節(jié)不便，因此二步鹽析正交試驗重點考慮（NH4）2SO4飽和度、pH和鹽析時間的影響，不考慮藻藍蛋白濃度因素。按照L9（43）建立正交試驗，影響因素及水平如表3所示。正交試驗的極差分析結(jié)果見表4。

表3　二步鹽析正交試驗影響因素及水平Table 3　Factors and levels of orthogonal experiment of the second salt precipitation

表4　二步鹽析正交試驗的極差分析結(jié)果Table 4　Results of orthogonal experiment of the first salt precipitation

由表4可以看出，各影響因素對純度的重要性為（NH4）2SO4飽和度 ＞pH＞鹽析時間。在（NH4）2SO4飽和度為25%～35%時，（NH4）2SO4飽和度影響最大，隨著（NH4）2SO4飽和度的增加，沉淀中藻藍蛋白純度增大。pH影響次之，酸性環(huán)境明顯優(yōu)于原水和堿性環(huán)境，這是因為藻藍蛋白的等電點在弱酸性（pH為4）附近，該環(huán)境利于藻藍蛋白沉淀析出。鹽析時間影響最弱，可以不考慮其影響，只需保證二步鹽析中（NH4）2SO4完全溶解即可，因此選定鹽析時間為15 min。綜合表4可知，在室溫（25℃）下，二步鹽析最優(yōu)工藝條件：（NH4）2SO4飽和度為35%，pH為4，鹽析時間為15 min。

2.5兩步鹽析最優(yōu)工藝條件試驗

在一步與兩步鹽析的正交試驗基礎(chǔ)上，進行最優(yōu)工藝條件試驗：在一步鹽析中選取（NH4）2SO4飽和度為17%，藻藍蛋白濃度為1.45 g/L，pH為6.8（即鹽析時間為 15 min；在二步鹽析中選?。∟H4）2SO4飽和度為35%，pH為6.8（工程應(yīng)用上盡量不調(diào)節(jié)pH），鹽析時間為15 min時，藻藍蛋白純度達到2.04。

3　結(jié)論

（1）鹽析法用于純化藻藍蛋白有良好的效果，一般需要進行兩步鹽析組合試驗，一步鹽析時較低（NH4）2SO4飽和度利于除去雜質(zhì)，二步鹽析時較高（NH4）2SO4飽和度利于沉淀更多的藻藍蛋白。

（2）一步鹽析中（NH4）2SO4飽和度合適區(qū)間為17%～24%，二步鹽析中（NH4）2SO4飽和度合適區(qū)間為29.28%～35.32%。

（3）一步鹽析最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為17%，藻藍蛋白濃度為1.45 g/L，pH為6.4，鹽析時間為15 min；二步鹽析最優(yōu)工藝條件是，（NH4）2SO4飽和度為35%，pH為4，鹽析時間為15 min。

（4）在最優(yōu)工藝條件下試驗，最終可得純度大于2的藻藍蛋白，為后期進一步純化提供了基礎(chǔ)。

［1］劉建康.高級水生生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1999：326-330.

［2］孔繁翔，宋立榮.藍藻水華形成過程及其環(huán)境特征研究［M］.北京：科學(xué)出版社，2011：2-50.

［3］韓士群，嚴少華，王震宇，等.太湖藍藻無害化處理資源化利用［J］.自然資源學(xué)報，2009，24（3）：431-437.

［4］朱守誠，苗春光，武艷，等.藍藻有機肥的制備及其對水稻生長的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：1513-1514.

［5］彭書傳，侯成虎，王進，等.玉米秸稈與巢湖藍藻混合厭氧發(fā)酵的產(chǎn)沼氣性能［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2012，28（15）：173-178.

［6］徐富，李學(xué)堯.藍藻厭氧消化產(chǎn)沼氣技術(shù)研究［J］.環(huán)境科學(xué)與管理，2013，38（1）：90-94.

［7］ROMAY C，GONZALEZ R，LEDON N，et al.C-phycocyanin：a biliprotein with antioxidant，anti-inflammatory and neuroprotective effects［J］.Current Protein and Peptide Science，2003，4（3）：207-216.

［8］王勇，錢峰，錢凱先.藻藍蛋白抗癌活性研究［J］.浙江大學(xué)學(xué)報，2001，35（6）：672-675.

［9］趙艷景，湯云成.條斑紫菜藻藍蛋白的分離純化及其抗衰老作用研究［J］.食品科學(xué)，2012，33（17）：94-97.

［10］汪興平，謝筆均，潘思軼，等.葛仙米藻藍蛋白抗氧化作用研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（12）：458-461.

［11］楊立紅，王曉潔，鐘旭升，等.魚腥藻藻藍蛋白的抗氧化作用［J］.食品科學(xué)，2006，27（12）：208-212.

［12］李濟平.藻藍蛋白對免疫系統(tǒng)的活性的研究［J］.中國公共衛(wèi)生，2000，16（7）：647-648.

［13］吳萍.藻膽蛋白與熒光免疫分析［J］.生理科學(xué)進展，2000，31（1）：82-84.

［14］ PATILG，CHETHANA S，SRIDEVIA S，et al.Method to obtain C-Phycocyanin of high purity［J］.Journal of Chromatography A，2006，1127（1）：76-81.

［15］胡一兵，胡鴻鈞，李夜光，等.從一種富含藻膽蛋白的螺旋藻中大量提取和純化藻藍蛋白的研究［J］.武漢植物學(xué)研究，2002，20（4）：299-302.

［16］溫少虹，趙呈龍，張莉萍.紫球藻B-藻紅蛋白的分離純化［J］.中國海洋藥物，2002，82（3）：33-35.

［17］ CAMREN S S，TERESA P N，ROXANA O R，et al.Extraction and purifieation of phycocyanin from Calothrix sp.［J］.Process Biochemistry，2004，39（12）：2047-2052.

［18］ MINKOVA K，TCHORBADJIEVA M，TCHEMOY A，et al. Improved procedure for separation and purification of Arihronema africanum phycobili proteins［J］.Biotechnology Letters，2007，29（4）：647-651.

［19］ BENAVIDES J，RITO-PALOMARES M.Simplified two-stage method to B-phycoerythrin recovery from Porphyridium cruentumn［J］.Joumal of Chromatography B，2006，844（1）：39-44.

［20］韓士群，李輝東，嚴少華，等.太湖藍藻藻藍蛋白的提取及純化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28（4）：777-782.

［21］HERRERA A，BOUSSIBA S，NAPOLENONE V，et al.Recovery of phycocyanin from the cyanobacterium Spirulina maxima［J］. Journal of Applied Phycology，1989，1（1）：325-331.

［22］ SONI B，KALAVADIA B，TRIVEDI U，et al.Extraction，purification and characterization of phycocyanin form Oscillatoria quadripunctulata-isolate form the rocky shores of Bet-Dwarka，Gujarat，India［J］.Process Biochemistry，2006，41（9）：2017-2023.?

Research on Technology Conditions of Purifying Phycocyanin from Fresh A lgae Using Salt Precipitation

ZHANG Fa-yu1，ZHAO Bing-bing1，CAI Jing2，YUAN Meng-yuan1，SHENG Jing-meng1，WANG Jia-quan1
1.School of Resources and Environmental Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China 2.School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China

The fresh blue-green algae in algae bloom were used for treatment and the crude extracts of phycocyanin were obtained by freeze-thaw method.On the basis of single-factor experiment of salt precipitation in the first and second steps，salt precipitation time，the impacts of phycocyanin concentration，pH and（NH4）2SO4saturation on the purifying phycocyanin were comprehensively considered using the orthogonal experiment.The results showed that the optimum conditions in the first step were 17%of（NH4）2SO4saturation，1.45 g/L of crude phycocyanin extract，pH 6.4 and 15 min of reaction time.In the second step，the optimum（NH4）2SO4saturation was 35%，with pH 4.0 and 15min of reaction time.The purity of phycocyanin was2.04 at last，which would facilitate further purification.

salt precipitation；purification；phycocyanin；orthogonal experiment

X703

1674-991X（2015）06-0499-05doi：10.3969/j.issn.1674-991X.2015.06.078

2015-06-21

國家“十二五”科技重大專項資助項目（2012ZX07103-004）

張發(fā)宇（1983—），男，講師，博士，主要研究方向為水處理技術(shù)，13655551436@139.com

*責(zé)任作者：汪家權(quán)（1957—），男，教授，博士，主要從事環(huán)境系統(tǒng)仿真與污染控制、環(huán)境規(guī)劃管理及水資源利用與保護，jiaquan.wang@163.com