夏楓峰，晁　敏，沈新強(qiáng)，王云龍

（1.舟山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江舟山　316000；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上?！?00090）

·研究簡(jiǎn)報(bào)·

制漿造紙廢水曝露對(duì)藻類(lèi)的毒性效應(yīng)

夏楓峰1，晁敏2，沈新強(qiáng)2，王云龍2

（1.舟山市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江舟山316000；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海200090）

以AOX含量為17.87 mg/L，CODCr含量為707.0 mg/L的化學(xué)制漿造紙漂白廢水為實(shí)驗(yàn)液，開(kāi)展其對(duì)三角褐指藻和扁藻的96 h毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)用造紙廢水對(duì)三角褐指藻和扁藻的96 h-EC50AOX濃度介于2.91～2.87 mg/ L，CODCr濃度介于176.3～138.7 mg/L。與同等稀釋條件下魚(yú)類(lèi)、蝦蟹類(lèi)和貝類(lèi)的實(shí)驗(yàn)相比，藻類(lèi)的敏感性較高。

毒性效應(yīng)；AOX；生長(zhǎng)抑制率

沿海地區(qū)的工業(yè)廢水通常選擇海洋處置方法，廢水出排放擴(kuò)散器后在海流作用下快速得到稀釋擴(kuò)散，然而含有持久性有機(jī)污染物的工業(yè)廢水如造紙廢水等進(jìn)行海洋處置需慎重考慮其對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)可能的風(fēng)險(xiǎn)影響，如經(jīng)氯漂白的造紙廢水中可能含有200多種有機(jī)氯化物，其中毒性最強(qiáng)的是被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為I類(lèi)人體致癌物的2，3，7，8-TCDD（二惡英的一種），這些難以降解的污染物可以通過(guò)食物鏈的累積作用進(jìn)而影響到人類(lèi)健康［1-3］。為限定廢水中有機(jī)氯化物總量，國(guó)際上通常以AOX（Absorbable organic halogens，可吸附有機(jī)鹵化物）作為替代具體有機(jī)氯化物的控制指標(biāo)。盡管我國(guó)《造紙工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB3544-2008）中也把AOX列為強(qiáng)制監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，針對(duì)不同企業(yè)排放標(biāo)準(zhǔn)作出了不同規(guī)定，但受到漂白工藝、造紙?jiān)?、溫度等多種因素的影響，產(chǎn)生的廢水中有機(jī)氯化物的種類(lèi)、含量有所不同，僅通過(guò)AOX值的大小難以反映出其毒性強(qiáng)弱和對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響。

近年來(lái)，生物監(jiān)測(cè)在水體污染調(diào)查研究中得到了廣泛應(yīng)用［4-5］。生物監(jiān)測(cè)基本原理就是將生物體暴露于污染物中，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析來(lái)評(píng)價(jià)污染物毒性的一種方法［6］。由于對(duì)污染物進(jìn)行單純的理化分析難以有效評(píng)價(jià)其潛在危害，而暴露于污染水體中的生物能夠在生長(zhǎng)過(guò)程中將污染物的影響反映出來(lái)，進(jìn)而對(duì)多種混合有毒物質(zhì)的毒性作出直觀、合理的評(píng)估［7-9］。鑒于不同生物對(duì)污染物的敏感程度不同，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了造紙廢水對(duì)多種生物的毒性效應(yīng)研究，受試生物涉及生態(tài)系統(tǒng)的各個(gè)層次，如細(xì)菌、貝類(lèi)、蝦蟹類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等［10-12］。藻類(lèi)是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，具有個(gè)體小、繁殖快、對(duì)毒物敏感等特點(diǎn)［7］。本文選擇三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum和扁藻Platymonas sp.兩種藻類(lèi)來(lái)研究不同稀釋濃度下造紙廢水的毒性效應(yīng)，對(duì)研究造紙廢水的最大安全稀釋度具有重要意義。

1　材料與方法

1.1藻類(lèi)培養(yǎng)

三角褐指藻和扁藻的采用海水鹽度為20的f/2藻類(lèi)生長(zhǎng)培養(yǎng)基［13］培養(yǎng)。取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液10 mL，接種于150 mL經(jīng)滅菌處理的三角燒瓶中，加培養(yǎng)液至總體積為50 mL，置于光照培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)，光、暗周期比設(shè)為12:12，為使藻類(lèi)在最適溫度條件下生長(zhǎng)，三角褐指藻培養(yǎng)溫度為16℃，扁藻為28℃［14］。

1.2造紙廢水對(duì)藻類(lèi)毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)用造紙廢水取自某紙業(yè)公司的化學(xué)制漿造紙漂白廢水，廢水經(jīng)初級(jí)沉淀、過(guò)50 μm醋酸纖維素濾膜，作為實(shí)驗(yàn)原液。

毒性試驗(yàn)設(shè)9個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)2個(gè)平行樣，各組試驗(yàn)液總量100 mL，含藻液20 mL，其余為造紙廢水和過(guò)濾海水按比例配比，其中，造紙廢水在各組的比例分別為80%、50%、22.2%、10%、5%、3.3%、1%、0.33%、0%，0%作為對(duì)照組。

毒性試驗(yàn)共進(jìn)行96 h，試驗(yàn)開(kāi)始后，分別于0、24、48、72和96 h取1 mL樣品，用顆粒計(jì)數(shù)儀Multisizer 3（COULTER Counter）測(cè)試藻類(lèi)數(shù)量。

實(shí)驗(yàn)液的CODCr采用重鉻酸鹽法測(cè)定，AOX采用有機(jī)鹵素（AOX）分析儀MULTI X2000（德國(guó)）測(cè)定，測(cè)定原理同庫(kù)侖法。

1.3數(shù)據(jù)處理

各時(shí)刻顆粒計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為藻細(xì)胞密度。以0 h的密度為基準(zhǔn)值，將0、24、48、72和96 h數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，0 h的標(biāo)準(zhǔn)化值為1。

以藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制率作為評(píng)價(jià)造紙廢水對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)毒性效應(yīng)的指示指標(biāo)，公式如下：

其中：Em為1:n稀釋比濃度某時(shí)刻的生長(zhǎng)抑制率（可取24、48、72和96 h）；Ntn為1:n稀釋比濃度某時(shí)刻的標(biāo)準(zhǔn)化值（可取24、48、72和96 h）；Ncn為對(duì)照組某時(shí)刻的標(biāo)準(zhǔn)化值（可取24、48、72和96 h）。

藻類(lèi)生長(zhǎng)受影響廢水濃度（Effective Concentration，EC）計(jì)算方法為：把造紙廢水稀釋濃度比轉(zhuǎn)化為稀釋百分比C，Ln（C）與某時(shí)刻藻類(lèi)生長(zhǎng)抑制率作線性回歸分析，利用SPSS軟件預(yù)測(cè)得藻類(lèi)不同比率條件下的EC值（如EC10、EC25、EC50、EC75等），同時(shí)可計(jì)算出EC的95%置信區(qū)間。

2　結(jié)果與分析

2.1廢水主要理化指標(biāo)

廢水中主要污染物含量以CODCr和AOX表示，表1列出了原液及不同稀釋比條件下的CODCr和AOX值，其中原液中AOX含量為17.87 mg/L，CODCr為707 mg/L，懸浮物含量為37 mg/L，略高于現(xiàn)行《造紙工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB3544-2008）對(duì)AOX規(guī)定排放最大限值（15 mg/L）。

表1　不同稀釋比下實(shí)驗(yàn)液的CODCr和AOX含量（mg/L）Tab.1　Concentrations of CODCrand AOX in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

2.2造紙廢水曝露條件下的藻類(lèi)生長(zhǎng)曲線

2.2.1三角褐指藻

三角褐指藻96 h生長(zhǎng)曲線如圖1所示，當(dāng)廢水按80%、50%、22.2%稀釋時(shí)，第24小時(shí)藻細(xì)胞負(fù)增長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖受到造紙廢水抑制，從第48小時(shí)開(kāi)始，22.2%組藻細(xì)胞密度有所增加，而80%、50%兩組藻細(xì)胞密度沒(méi)有繼續(xù)增加。在第24小時(shí)，10%～0.33%組及對(duì)照組的藻細(xì)胞密度均沒(méi)有明顯增長(zhǎng)，從第48hr開(kāi)始各組細(xì)胞開(kāi)始增殖，對(duì)照組生長(zhǎng)速率一直最高，10%組一直最低。

圖1　三角褐指藻在不同稀釋濃度實(shí)驗(yàn)條件下的96 h生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curves of Phaeodactylum tricornutum in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

圖2　扁藻在不同稀釋濃度實(shí)驗(yàn)條件下的96 h生長(zhǎng)曲線Fig.2　Growth curves of Platymonas sp.in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent

2.2.2扁藻

扁藻96 h生長(zhǎng)曲線如圖2所示，第24小時(shí)所有組包括對(duì)照組生長(zhǎng)速率均很低，從第48小時(shí)開(kāi)始各組細(xì)胞開(kāi)始增殖，對(duì)照組生長(zhǎng)速率一直最高，80%組一直最低。

2.2.3不同時(shí)刻藻類(lèi)密度標(biāo)準(zhǔn)化值分布曲線

（1）三角褐指藻：從圖3三角褐指藻密度標(biāo)準(zhǔn)化曲線直觀判斷，5%濃度及低濃度在24、48、72 h標(biāo)準(zhǔn)化密度基本接近，將三角褐指藻5%～0.33%濃度范圍第24、48、72和96小時(shí)藻類(lèi)生長(zhǎng)速率分別與對(duì)照組生長(zhǎng)速率作t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，24、48和72 h三角褐指藻生長(zhǎng)速率與對(duì)照組無(wú)顯著差異（p值分別為0.09、0.31、0.26），而96hr具有顯著差異（p值為0.02）。以上結(jié)果表明低濃度廢水曝露（5%～0.33%）對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)的抑制主要發(fā)生在第4天。

（2）扁藻：把扁藻5%～0.33%濃度范圍24、48、72和96 h生長(zhǎng)速率分別與對(duì)照組生長(zhǎng)速率作t檢驗(yàn)，結(jié)果表明第24和48小時(shí)三角褐指藻生長(zhǎng)速率與對(duì)照組無(wú)顯著差異（p值分別為0.757、0.24），而72和96 h具有顯著差異（p值分別為0.009和0.022）。以上結(jié)果表明低濃度廢水曝露（5%～0.33%）對(duì)扁藻生長(zhǎng)的抑制主要發(fā)生在第3天以后。

圖3　三角褐指藻和扁藻24、48、72和96 h密度標(biāo)準(zhǔn)化值分布曲線Fig.3　Distribution curves of density standardization for Phaeodactylum tricornutum and Platymonas sp.in the dilution gradient solutions from pulp mill effluent in different time

2.3造紙廢水曝露對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)影響濃度

造紙廢水稀釋濃度取對(duì)數(shù)，與三角褐指藻、扁藻的96 h生長(zhǎng)抑制率分別作線性回歸分析，得線性方程為：

三角褐指藻：Ln（C）=6.111×抑制率%-6.328 1（R2=0.92）

扁藻：Ln（C）=7.932 3×抑制率%-7.118 3（R2=0.95）

經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果分別為F（1，7）=79.458，p=0.000 01＜＜0.000 1；F（1，7）=130.108，p=0.000 06＜＜0.000 1，表明兩種受試藻類(lèi)的Ln（C）與抑制率之間均存在極顯著線性相關(guān)關(guān)系。

利用SPSS軟件預(yù)測(cè)兩種受試藻類(lèi)不同生長(zhǎng)抑制率的曝露濃度及95%置信區(qū)間（表2），其中96 h-EC50值分別為3.79%、4.28%（體積百分比），95%置信區(qū)間分別為2.20%～6.52%、2.78%～6.57%。

表2　三角褐指藻50%生長(zhǎng)抑制率時(shí)的稀釋濃度及其95%置信區(qū)間Tab.2　Dilution volume fractions for Phaeodactylum tricornutum in growth inhibitions 50%

3　討論與結(jié)論

藻類(lèi)是海洋中初級(jí)生產(chǎn)力提供者，造紙廢水入海后對(duì)浮游植物生長(zhǎng)抑制程度成為影響受納海域生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的重要因素。研究證明，藻類(lèi)比魚(yú)類(lèi)、無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)造紙廢水中有機(jī)氯化物更敏感，如在波羅地海水域，廢水中含有50 mg/L的氯酸鹽就可使12 km2海域范圍的大型褐藻消失，取而代之的是藍(lán)綠藻和紅藻，初級(jí)生產(chǎn)力和浮游動(dòng)物區(qū)系也相應(yīng)受到長(zhǎng)久性影響［15］。KALLQVIST等［16］的研究表明，當(dāng)廢水中AOX含量為3.6 kg/t（16.4 mg/L）時(shí)對(duì)中肋骨條藻的EC50為2.4%～2.9%。

實(shí)驗(yàn)用造紙廢水對(duì)三角褐指藻和扁藻的96 h-EC50稀釋濃度比分別為3.79%和4.28%，其AOX含量介于2.91～2.87 mg/L，CODCr含量介于176.3～138.7 mg/L。同等稀釋條件下，該造紙廢水對(duì)斑馬魚(yú)Brachydanio rerio、對(duì)脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis大眼幼體和縊蟶Sinonovacula constricta 96 h-LC50（半致死濃度）稀釋濃度比分別為7.14%、14.3%、44.4%和62.9%［11］。造紙廢水對(duì)藻類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)、蟹類(lèi)、貝類(lèi)的毒性效應(yīng)依次降低，藻類(lèi)的敏感性高于魚(yú)類(lèi)、蝦蟹類(lèi)和貝類(lèi)，這與BAILEY等［17］研究的造紙廢水對(duì)不同種類(lèi)淡水水生生物敏感性結(jié)論相一致。

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Exposure Effect of Pulp Mill Effluent on the Growth of Algae

XIA Feng-feng1，CHAO Min2，SHEN Xin-qiang2，et al
（1.Fisheries Technology Extending Stations of Zhoushan City，Zhanshan316000；2.East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China）

The 96 hr algae growth inhibition tests of Phaeodactylum tricornutum and Platymonas sp.were conducted on dilution gradient solutions from pulp mill effluent，which contained 17.87 mg/L AOX，707.0 mg/L CODCr.It showed that the algal 96 h-EC50varied from 2.87 to 2.91 mg/L for AOX，and from 138.7-176.3 mg/L for CODCr.Algae exhibited the greatest sensitivity compared with fish，shrimp，crab and shellfish on the same diluted series test.

toxic effect；AOX；growth inhibition

X503.225

A

1008-830X（2015）02-0192-04

2014-12-10

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2010CB429005）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所）（2007M02）

夏楓峰，女，浙江舟山人，研究方向：養(yǎng)殖生態(tài).