楊靜+++++張建軍++++++鐘森

[摘要] 目的 研究中藥雄黃主要成分As2S2對人肝癌細胞株QGY-77 03增值和凋亡的影響及其可能機制。方法 2012年9月—2013年4月，分析不同濃度的As2S2處理QGY-7703細胞后，MTT法測定細胞增殖抑制率；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；免疫細胞化學(xué)方法檢測PCNA的表達情況。結(jié)果 較低濃度（7.5 mg/L）的As2S2對QGY-7703細胞的生長無影響；15～120 mg/L的As2S2可抑制細胞的生長，具有時間依賴性和濃度依賴性（P<0.01）。As2S2在15～30 mg/L范圍內(nèi)，細胞凋亡率隨濃度和作用時間增加而增加（P<0.01）；60 mg/L組凋亡率比低濃度組低，表現(xiàn)為繼發(fā)性壞死細胞增多。As2S2處理組可明顯降低PCNA蛋白的陽性表達（P<0.01）。 結(jié)論 As2S2在一定的濃度范圍內(nèi)可以誘導(dǎo)QGY-7703細胞發(fā)生凋亡，通過下調(diào)PCNA的表達抑制細胞的增殖，隨著作用時間的延長和（或）濃度的提高，As2S2表現(xiàn)出一定的細胞毒作用，促進腫瘤細胞壞死。

[關(guān)鍵詞] 雄黃；肝細胞癌；凋亡

[中圖分類號] R736 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）01（b）-0012-02

Effects of Realgar on the Proliferation and Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line QGY-7703

YANG Jing1 ZHANG Jianjun2 ZHONG Sen3

1.Department of Infectious Diseases， Yaan People's Hospital， Yaan， Sichuan Province， 625000， China；

2.Department of Infectious Diseases， The Affiliated Hospital of Luzhou Medical College， Luzhou， Sichuan Province， 646000， China；

3.Department of Hepatopathy， Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M， Chengdu， Sichuan Province， 610072， China

[Abstract] Objective To study the effect of realgar main component As2S2 on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line QGY-7703 and the possible mechanism. Methods From September 2012 to April 2013 QGY-7703 cell was treated by different concentrations of As2S2 first， then the cell proliferation inhibition rate of QGY-7703 cell was detected by MTT method； the cell apoptosis was tested by flow cytometry； the expression of PCNA was detected by immunocytochemistry method. Results As2S2 at low concentration（7.5mg/L） had no effect on the growth of QGY-7703 cells； As2S2 with the concentration of 15mg/L～120mg/L could inhibit the growth of QGY-7703 cells， the inhibitory rate depended on the concentration and time （P<0.01）. As2S2 with the concentration of 15 mg/L～30 mg/L， the cell apoptotic rate increased with the increase of concentration and action time （P<0.01）. The cell apoptotic rate of 60 mg/L group was lower than those of low concentration groups， and the secondary necrotic cells increased. The positive expression level of PCNA protein of As2S2 group decreased significantly（P<0.01）. Conclusion As2S2 in a certain range of concentration can induce the apoptosis of QGY-7703 cells， inhibit the proliferation of the cells by down-regulation of the expression of PCNA. And as the longer duration of action and（or） the increase of the concentration， As2S2 showed certain cytotoxic effect， promoting tumor cell necrosis.

[Key words] Realgar； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis

雄黃的主要成分為As2S2，具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧的功效[1]，常用來治療癰腫療瘡、蛇蟲咬傷、蟲積腹痛、驚癇和瘧疾等疾病。近年來，As2O3在白血病的治療中療效顯著，已被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的研究和臨床治療。作為毒性更小的含砷化合物，雄黃及其復(fù)方制劑在白血病治療中也取得了可喜的成績[2]，其抗腫瘤效應(yīng)及機制的研究也越來越深入[3]。但有關(guān)雄黃對實體瘤的報道較少。自2012年9月—2013年4月，該實驗以人肝癌細胞株QGY-7703細胞為研究對象，探討雄黃的主要成分As2S2對肝癌細胞的影響及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

As2S2（純度98%）購自美國Sigma公司，配制方法參照文獻4，RPMI 1640袋裝培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青生物公司，DMSO及MTT購自美國Amresco公司，AnnexinV-FITC 凋亡檢測試劑盒購自美國Beckman公司，鼠抗人PCNA單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。人肝癌細胞株QGY-7703由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗室提供。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株QGY-7703常規(guī)復(fù)蘇后用含10%新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液中分別含有青霉素、鏈霉素各100 U/mL。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 MTT法觀察As2S2對肝癌細胞株增殖的影響

將QGY-7703細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為3.0×104 個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)（200 μL/孔），同時設(shè)實驗組（不同濃度的As2S2處理）、對照組（不加藥物的細胞）和空白組（調(diào)零），每組設(shè)5個復(fù)孔。次日細胞貼壁后，實驗組棄去培養(yǎng)液加不同濃度的As2S2，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入MTT液20 μL（5 g/L），于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測定其吸光度（A）值，按公式計算：細胞增殖抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.4 流式細胞儀技術(shù)觀察As2S2對肝癌細胞株凋亡的影響

胰蛋白酶消化細胞成單細胞懸液，以1.0×105 個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)（2.5 mL/孔）。次日細胞貼壁后，實驗組加入含不同濃度As2S2的培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)48 h、72 h后，棄去培養(yǎng)液，收集細胞。實驗組分別加入Annexin V （FITC標記） 5 μL、PI 2.5 μL，避光冰上孵育10 min，進行流式細胞儀檢測。

1.5 免疫細胞化學(xué)方法檢測PCNA的表達

胰蛋白酶消化細胞成單細胞懸液，以4×104 個/mL的密度接種于預(yù)置玻片（經(jīng)多聚賴氨酸處理）的6孔培養(yǎng)板內(nèi)（2.5 mL/孔），置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。次日細胞貼壁后，實驗組棄去培養(yǎng)液，每孔重新加入含不同濃度As2S2的培養(yǎng)基2.5 mL，使As2S2終濃度分別為15 mg/L、30 mg/L。培養(yǎng)48 h后，取出玻片按SABC法進行免疫細胞化學(xué)染色，按試劑盒說明書操作，PBS代替一抗作陰性對照。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)士標準差（x±s）表示，采用單向方差分析（One-way ANOVA），各實驗組與對照組間比較用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 As2S2對QGY-7703細胞增殖的影響

7.5 mg/L As2S2對QGY-7703細胞生長無影響（P>0.05）。15～120 mg/L的As2S2可抑制細胞的生長，且在此范圍內(nèi)抑制率隨著濃度增加而增加，具有時間依賴性和濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。15 mg/L As2S2處理組作用24 h抑制率是（8.01±1.93）%，72 h達（59.93±4.63）%。而120 mg/L As2S2處理組作用24 h、72 h的抑制率分別是（43.10±1.79）%、（83.56±3.49）%。As2S2的濃度、作用時間和抑制率之間的關(guān)系見圖1。

圖1 不同濃度As2S2對QGY-7703細胞生長的抑制曲線

2.2 流式細胞儀檢測As2S2對QGY-7703細胞凋亡的影響

如表1所示，與對照組比較，實驗組細胞凋亡率呈不同程度上升，與此同時，活細胞數(shù)隨雄黃濃度增高而急劇下降。As2S2在15～30 mg/L范圍內(nèi)，細胞凋亡率隨濃度增加而增加，而繼發(fā)性壞死細胞比例也在增加。60 mg/L組出現(xiàn)細胞凋亡率較低濃度組減低，表現(xiàn)為繼發(fā)性壞死細胞增多。

表1 As2S2對QGY-7703細胞凋亡率的影響（x±s）

注：▲與對照組（0 mg/L）比較， P<0.01；○與對照組比較， P<0.05。

2.3 免疫細胞化學(xué)方法檢測As2S2對QGY-7703細胞PCNA表達的影響

PCNA蛋白陽性表達均定位于細胞核。凡細胞核內(nèi)見有均勻一致分布的棕黃色顆粒，胞漿不著色者即為陽性細胞。As2S2處理組可明顯降低PCNA蛋白的陽性表達（見表2）。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，預(yù)后差。以化療為主的綜合治療對于不能手術(shù)切除的肝癌仍是目前主要的治療手段。但由于傳統(tǒng)化療藥物存在副作用大、敏感性低、易產(chǎn)生多藥耐藥性等缺點而效果不佳，因此尋求新的有效的化療藥物對于肝癌的治療有重要意義。

近年來，雄黃在臨床上已成功用于白血病的治療，并開始應(yīng)用于抗其它血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實體瘤的研究。龐琦等[5]建立膠質(zhì)瘤動物模型，雄黃局部注射治療腫瘤，體外實驗也證實雄黃對肺腺癌細胞、骨肉瘤細胞、胰腺癌細胞、胃癌細胞及卵巢癌細胞都有抑制增值并誘導(dǎo)凋亡的作用[6-10]。目前研究認為雄黃抗腫瘤作用的機制可能為：①誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；②抑制腫瘤細胞增殖；③促進腫瘤細胞分化；④抗腫瘤血管生成[3]。

張晨[11]報道，雄黃對人肝癌細胞株BEL-7402有明顯細胞毒作用，不僅可抑制肝癌細胞的生長增殖，并且可誘導(dǎo)細胞凋亡的產(chǎn)生，實驗組中與細胞凋亡相關(guān)的兩種蛋白Ap02.7和Fas均有表達增加的趨勢。黃姣娥等[12]報道雄黃對人肝癌細胞株BEL-7402的抗腫瘤作用機制與升高細胞內(nèi)鈣、降低細胞線粒體膜電位并誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

該實驗通過MTT法也觀察到相似的結(jié)果，在15～120 mg/L濃度范圍內(nèi)，As2S2能抑制QGY-7703細胞的生長，抑制作用隨著藥物濃度的提高、作用時間的延長而增強，呈時效和量效關(guān)系。該研究免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)的QGY-7703細胞，PCNA陽性表達率較高，經(jīng)As2S2作用48 h后，PCNA的表達明顯下降，其降低程度與藥物濃度呈明顯的正相關(guān)。據(jù)此推測，As2S2抑制細胞增殖的可能機制之一是抑制了參與DNA合成的PCNA，從而導(dǎo)致DNA合成受阻，進而抑制了細胞增殖。

該研究中，QGY-7703細胞的自發(fā)凋亡率較低，可部分解釋肝癌對放療敏感性較差這一現(xiàn)象。As2S2以15 mg/L、30 mg/L、60 mg/L三個濃度分別作用于QGY-7703細胞48 h、72 h。與對照組比較，試驗組QGY-7703細胞的凋亡率不同程度增加，但并非呈時間依賴性和濃度依賴性。隨著藥物濃度的提高和作用時間的延長，細胞凋亡率反而降低，表現(xiàn)為以繼發(fā)性壞死細胞為主。表明As2S2在一定的濃度范圍內(nèi)具有誘導(dǎo)QGY-7703細胞凋亡的作用，但隨著作用時間增加和濃度的提高則表現(xiàn)出細胞毒作用，促進腫瘤細胞壞死。

該實驗僅是雄黃對肝癌細胞作用的初步研究，因其未設(shè)陽性對照組，僅以一株肝癌細胞為研究對象，且尚未進行動物體內(nèi)的抑瘤實驗，有待今后增加對肝癌細胞系的研究，并對其機制作進一步深入探討。

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（收稿日期：2014-11-20）