馬鈴薯六種主要病毒通用RT-PCR檢測(cè)體系的建立

張威，白艷菊*，文景芝，范國(guó)權(quán)，高艷玲，申宇，張抒，孟憲欣，王軍

病蟲防治

馬鈴薯六種主要病毒通用RT-PCR檢測(cè)體系的建立

張威1，白艷菊1*，文景芝2，范國(guó)權(quán)1，高艷玲1，申宇1，張抒1，孟憲欣3，王軍4

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所，黑龍江哈爾濱150086；4.北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱150090）

馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯M病毒（PVM）和馬鈴薯A病毒（PVA）是馬鈴薯生產(chǎn)田中發(fā)生率較高、危害較嚴(yán)重的病毒，因此，建立特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快的RT-PCR分子檢測(cè)體系對(duì)保障馬鈴薯種薯質(zhì)量具有非常重要的意義。試驗(yàn)篩選了6種病毒的特異引物、優(yōu)化了PCR部分的試劑以及確定了退火溫度。結(jié)果表明，當(dāng)Mg2+濃度為2.6 mmol/L、dNTPs濃度為0.1 mmol/L、Taq DNA聚合酶濃度為0.03 U/μL，以及退火溫度為55.5℃時(shí)反應(yīng)體系最穩(wěn)定。最終，建立了一套通用RT-PCR檢測(cè)體系，只需要變換每種病毒的引物，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM和PVA病毒的RT-PCR檢測(cè)。每種病毒檢測(cè)靈敏度均能達(dá)到pg以上。

馬鈴薯；PVX；PVY；PVS；PLRV；PVM；PVA

馬鈴薯是世界上最重要的糧食作物之一，具有分布范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、用途廣等特點(diǎn)。中國(guó)馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量均居世界首位［1］，然而整體生產(chǎn)水平卻只有馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)達(dá)國(guó)家荷蘭平均單產(chǎn)的32%［2］。其中病毒病是降低馬鈴薯種薯產(chǎn)量，引起種性退化的主要原因。

目前，生產(chǎn)上發(fā)生普遍、危害較嚴(yán)重的6種主要病毒有：馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯M病毒（PVM）和馬鈴薯A病毒（PVA）［3-7］，是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約瓶頸［8，9］?，F(xiàn)階段對(duì)病毒病尚沒(méi)有有效的治療辦法，只能預(yù)防［10］。病毒檢測(cè)是防治措施中最為重要的環(huán)節(jié)，也是種薯質(zhì)量認(rèn)證的關(guān)鍵指標(biāo)。

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）是從分子水平上對(duì)病毒的RNA進(jìn)行檢測(cè)，以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)在病毒檢測(cè)中日益顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。6種病毒RT-PCR的檢測(cè)體系都具有獨(dú)特性，其中PCR部分各試劑用量、退火溫度等都具有不同要求，為了提高6種病毒的檢測(cè)效率，簡(jiǎn)化操作步驟，通過(guò)對(duì)每種病毒PCR部分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶濃度工作范圍，以及退火溫度梯度等試驗(yàn)研究，最終，建立了一套通用RT-PCR檢測(cè)體系，只需要變換每種病毒的引物，其他試劑用量和程序不變，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)這6種病毒的檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品來(lái)源

從馬鈴薯現(xiàn)蕾期到收獲期，對(duì)內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、云南等主要馬鈴薯產(chǎn)區(qū)進(jìn)行樣品采集，主要采集花葉、卷葉、壞死、皺縮、矮化等典型病毒病癥狀或疑似病毒病癥狀的樣品，應(yīng)用英國(guó)ADGEN公司的馬鈴薯病毒DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA檢測(cè)，陽(yáng)性樣品于-70℃冰箱保存?zhèn)溆茫?種病毒的陰、陽(yáng)性對(duì)照由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所提供。

1.1.2主要試劑

Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promeger公司；dNTPs、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、Eco R I、Sal I和pMD18-T均購(gòu)自TaKaRa（大連）公司；大腸桿菌Escherichia coli GM109由實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA片段回收試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純；引物合成及序列測(cè)定委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物的篩選

每種病毒從中、英文文獻(xiàn)中查找多對(duì)引物，篩選出CP（Coat protein，CP）保守區(qū)的引物；用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選分值高的引物；然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，篩選出只能擴(kuò)增得到特異性條帶的引物，經(jīng)綜合考慮，最終每種病毒篩選1對(duì)特異性引物（表1）。

1.2.2總RNA提取

參照TrizolReagent（InvitrogenTM）說(shuō)明書，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)：將樣品置于研缽中，加液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管，加入1 mL Trizol混勻，使其充分裂解；4℃、14 000 r/min離心5 min；取上清，加入200μL三氯甲烷，振蕩混勻，室溫放置15 min；4℃，12 000 r/min離心15 min；吸取上層水相至新1.5 mL離心管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻，室溫放置10 min；4℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清，留沉淀，加入1 mL 75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；4℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，將離心管倒置于濾紙上，自然干燥；加入25～100μL DEPC水溶解沉淀，即得到RNA。

1.2.3提取RNA質(zhì)量的檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值，鑒定總RNA的純度。

1.2.4RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄體系：取2.5μL RNA，65℃加熱8 min，冰上放置2 min；再加入下游引物（100 ng/μL）0.5μL，5 3 5 CVGGFS 1μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1μL，RNase Inhibitor5 U，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶100 U，用ddH2O補(bǔ)足至10μL，短暫離心。反應(yīng)程序：42℃反應(yīng)1 h，92℃滅活2 min，-20℃保存待用。

PCR反應(yīng)體系：取2μL cDNA，10 1 3 buffer 2.5μL，上、下游引物（100 ng/μL）各0.5μL。分別對(duì)6種病毒反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶濃度進(jìn)行優(yōu)化：dNTPs濃度選擇在0.1～0.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶濃度選擇在0.01～0.05 U/μL，Mg2+濃度選擇在1.0～3.7 mmol/L。

PCR反應(yīng)程序：92℃預(yù)變性5 min；92℃變性30 s，退火溫度設(shè)定49.0～60.3℃、30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)30次；72℃延伸8 min。

1.2.5PCR產(chǎn)物的檢測(cè)、克隆與測(cè)序

反應(yīng)結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L的溴化乙錠）電泳檢測(cè)。用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

RT-PCR產(chǎn)物純化后分別連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到GM109感受態(tài)細(xì)胞中。挑取的抗性單菌落擴(kuò)繁后，試劑盒提取質(zhì)粒，再應(yīng)用Eco R I和Sal I對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。目的片段進(jìn)行測(cè)定，采用DNAstar軟件進(jìn)行序列分析。

表1　病毒特異性引物Table 1 Specific primers of viruses

表2　RNA的紫外吸收值Table 2 Ultraviolet absorption value of RNA

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA提取質(zhì)量

試驗(yàn)采用Trizol法提取總RNA，為保障RT-PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，必須使用純度較高、完整性較好的RNA。從表2可以看出，試驗(yàn)提取的總RNA OD260/OD280比值均為1.80～1.90，表明植物組織中的酚類化合物、多糖和蛋白質(zhì)等已基本去除，總RNA純度較理想。

2.2PCR部分試劑濃度確定

通過(guò)分別對(duì)PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA6種病毒PCR部分的Mg2+（1.0～3.7 mmol/L）、dNTPs（0.1～0.5 mmol/L）、Taq DNA聚合酶（0.01～0.05 U/μL）進(jìn)行單因子工作濃度確定。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定當(dāng)dNTPs濃度在0.1 mmol/L、Mg2+濃度在2.6 mmol/L、Taq DNA聚合酶濃度在0.03 U/μL時(shí)，6種病毒的RT-PCR均能達(dá)到檢測(cè)穩(wěn)定的狀態(tài)，而且應(yīng)用一套通用RT-PCR檢測(cè)體系，只需要變換每種病毒的引物，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)這6種病毒進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率，簡(jiǎn)化了操作步驟且達(dá)到節(jié)約成本的目的。

2.3RT-PCR反應(yīng)程序退火溫度確定

通過(guò)分別對(duì)PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA6種病毒RT-PCR退火溫度梯度的試驗(yàn)，確定了每種病毒的退火溫度范圍，從表3可以看出，退火溫度在51.9～58.6℃時(shí)，6種病毒都能擴(kuò)增得到目的片段，最終選擇中間值55.5℃為體系的退火溫度。

2.46種病毒通用RT-PCR檢測(cè)體系的建立

通過(guò)對(duì)6種病毒PCR部分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶濃度工作范圍，以及退火溫度梯度等試驗(yàn)，最終建立了一套通用RT-PCR檢測(cè)體系（表4）。

表3　6種病毒的退火溫度范圍Table 3 Annealing temperature range of six viruses

表4　PCR反應(yīng)體系Table 4 PCR reaction system

分別以感染病毒的馬鈴薯葉片總RNA為模板，對(duì)6種病毒分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。從圖1看出，泳道2，3，4，5，6和7分別擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為273 bp，336 bp，447 bp，520 bp，711 bp和729 bp的6條特異性條帶，而陰性對(duì)照無(wú)此條帶，成功擴(kuò)增得到PVA、PLRV、PVY、PVM、PVX和PVS病毒。

2.5RT-PCR產(chǎn)物的克隆與序列測(cè)定

將6種病毒的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，克隆到pMD18-T載體上，試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒的插入片段進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果用DNAstar軟件分析，分析結(jié)果顯示：PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA的擴(kuò)增產(chǎn)物分別由711，447，729，336，520和273個(gè)核苷酸組成，與預(yù)期片段大小相同，序列與相應(yīng)病毒序列同源性均在98.5%以上，證明RT-PCR檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

2.6通用RT-PCR檢測(cè)體系的靈敏度

提取PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA病毒的RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度依次為921.30 ng/μL，1 120.50 ng/μL，605.75 ng/μL，160.35 ng/ μL，66.78 ng/μL和561.00 ng/μL，每一種病毒的RNA經(jīng)過(guò)濃度梯度稀釋后再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表5，經(jīng)計(jì)算6種病毒的RT-PCR檢測(cè)體系最低能檢測(cè)出RNA濃度分別為368 pg/μL，448 pg/μL，303 pg/ μL，107 pg/μL，66 pg/μL和374 pg/μL。

2.7應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)馬鈴薯田間樣品進(jìn)行檢測(cè)

分別應(yīng)用PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA 6種病毒RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)已知帶毒情況的田間采集的馬鈴薯病葉和脫毒試管苗進(jìn)行檢測(cè)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果非常準(zhǔn)確。圖2為代表性樣品的電泳圖。

3　討論

PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA是馬鈴薯生產(chǎn)田中發(fā)生率較高、危害較嚴(yán)重的病毒，也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《馬鈴薯種薯》（GB18133-2008）中規(guī)定的馬鈴薯種薯必須檢測(cè)的病毒。目前馬鈴薯質(zhì)檢單位和科研機(jī)構(gòu)主要采用血清學(xué)DAS-ELISA方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，此方法雖適合樣品量較大的田間樣品的檢測(cè)，但不適用于病毒濃度較低的馬鈴薯脫毒試管苗和休眠薯塊的檢測(cè)，馬鈴薯試管苗作為源頭，其脫毒是否徹底關(guān)系到各級(jí)種薯的質(zhì)量，因此，需要配套更靈敏的檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)，RT-PCR檢測(cè)技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等特點(diǎn)在病毒檢測(cè)上得到應(yīng)用，可以彌補(bǔ)DAS-ELISA檢測(cè)方法的不足，對(duì)試管苗、休眠薯塊等樣品都可以進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。

圖1　馬鈴薯六種病毒通用RT-PCR檢測(cè)體系的建立Figure 1 Establishment of RT-PCR detection system for six potato viruses

表5　通用RT-PCR檢測(cè)體系的靈敏度Table 5 Universal RT-PCR detection system sensitivity

圖2　應(yīng)用RT-PCR對(duì)馬鈴薯田間樣品的檢測(cè)Figure 2 Detection of potato field samples using RT-PCR

通過(guò)分別對(duì)6種病毒引物篩選、PCR部分各試劑工作濃度以及每種病毒退火溫度確定，最終建立一套通用RT-PCR分子檢測(cè)體系，只需要變換每種病毒的引物，就可以實(shí)現(xiàn)分別對(duì)PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA病毒的RT-PCR檢測(cè)。在RT-PCR反應(yīng)體系中，引物的選擇對(duì)試驗(yàn)的成敗起關(guān)鍵性作用［18］，既要使引物能對(duì)病毒進(jìn)行特異性擴(kuò)增，又要使引物能對(duì)同一病毒的不同株系進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以保障不漏檢病毒。本研究從中、英文文獻(xiàn)中每種病毒查找多對(duì)引物，首先在GenBank上將每種病毒不同分離物的CP基因進(jìn)行多序列比對(duì)，篩選出在保守區(qū)的引物，然后用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選效果好的引物，然后再用RT-PCR體系擴(kuò)增，篩選出能擴(kuò)增得到特異性條帶而無(wú)雜帶的引物，最終每種病毒篩選到一對(duì)特異性引物。其次，PCR部分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶濃度對(duì)試驗(yàn)成敗起關(guān)鍵作用，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定當(dāng)dNTPs濃度在0.1 mmol/ L、Mg2+濃度在2.6 mmol/L、Taq DNA聚合酶濃度在0.03 U/μL時(shí)，6種病毒的RT-PCR均能達(dá)到檢測(cè)穩(wěn)定的狀態(tài)。再次，PCR反應(yīng)程序中退火溫度對(duì)反應(yīng)的影響很大，通過(guò)對(duì)每種病毒RT-PCR退火溫度梯度進(jìn)行試驗(yàn)，確定了退火溫度在51.9～58.6℃6種病毒都能擴(kuò)增得到目的片段，最終選擇中間值55.5℃為體系的退火溫度。

本研究還對(duì)6種病毒RT-PCR檢測(cè)體系的靈敏度進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)每一種病毒的RNA經(jīng)過(guò)濃度梯度稀釋后再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)計(jì)算6種病毒的RT-PCR檢測(cè)體系最低能檢測(cè)出RNA濃度分別為368 pg/μL，448 pg/μL，303 pg/μL，107 pg/μL，66 pg/μL和374 pg/μL，均達(dá)到pg以上。

最后，分別應(yīng)用PVX，PVY，PVS，PLRV，PVM和PVA 6種病毒通用RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)已知帶毒情況的田間采集的馬鈴薯病葉和脫毒試管苗進(jìn)行檢測(cè)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果非常準(zhǔn)確，但對(duì)病毒含量較低的脫毒試管苗來(lái)說(shuō)，RT-PCR檢測(cè)的靈敏度更高，因此該體系完全可以應(yīng)用于馬鈴薯上述6種病毒的田間檢測(cè)。

［1］張威，白艷菊，高艷玲，等.馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況調(diào)查［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：71-74.

［2］王迎男，賈立國(guó)，樊明壽.2010～2012年世界各洲及各洲主要生產(chǎn)國(guó)馬鈴薯生產(chǎn)狀況分析［M］//屈冬玉，陳伊里.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與現(xiàn)代可持續(xù)農(nóng)業(yè).哈爾濱：哈爾濱地圖出版社，2015.

［3］Solomon-Blackburn R M，Barker H.Breeding virus resistant potatoes（Solanum tuberosum）：a review of traditional and molecular approaches［J］.Heredity，2001，86：17-35.

［4］鐘婷婷，蒲志剛，何俊蓉，等.四川省馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)最新病毒病普查及血清學(xué)鑒定［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（1）：96-99.

［5］劉洪義，張洪祥，李明福，等.黑龍江省馬鈴薯病毒病的普查及鑒定［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（3）：307-310.

［6］白艷菊，文景芝，楊明秀，等.西南地區(qū)與東北地區(qū)馬鈴薯主要病毒發(fā)生比較［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（6）：733-736.

［7］張仲凱，丁銘，方琦，等.云南馬鈴薯病毒種類及脫病毒種苗篩選技術(shù)體系［J］.云南農(nóng)業(yè)科技，2003（增刊）：121-130.

［8］Jansky S，Jin L，Xie K，et al.Potato production and breeding in China［J］.Potato Research，2009，52（1）：57-65.

［9］Wang Q，Zhang W.An economic analysis of potato demand in China［J］.American Journal of Potato Research，2010，87（3）：245-252.

［10］吳興泉，陳士華，謝聯(lián)輝.馬鈴薯X病毒的分子鑒定與檢測(cè)技術(shù)［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（2）：72-75.

［11］張威，白艷菊，申宇，等.馬鈴薯X病毒黑龍江分離物外殼蛋白基因克隆與序列分析［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（8）：1-5.

［12］孫琦，張春慶，孟昭東，等.馬鈴薯X、Y病毒的復(fù)合RT-PCR檢測(cè)體系的建立［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，17（4）：737-738.

［13］Crosslin J M，Hamlin L L.Standardized RT-PCR conditions for detection and identification of eleven viruses of potato and potato spindle tuber viroid［J］.American Journal of Potato Research，2011，88：333-338.

［14］Nie X，Singh R P.A novel usage of random primers for multiplex RT-PCR detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tuber［J］. JournalofVirologicalMethods，2001，91：37-49.

［15］Singh R P，Nie X Z，Singh M.Duplex RT-PCR：Reagent concentrations at reverse transcription stage affect the PCR performance［J］.Journal of Virological Methods，2000，86：121-129.

［16］Nie X Z，Singh R P.Detection of multiple potato viruses using an oligo（dT）as a common cDNA primer in multiplex RT-PCR［J］. JournalofVirologicalMethods，2000，86：179-185.

［17］Xu H，D'Aubin J，Nie J.Genomic variability in potato virus M and the developmentof RT-PCR and RFLP procedures for the detection ofthis virus in seed potatoes［J］.Virology Journal，2010：25（7）：1-7.

［18］鄭軒，成巨龍，趙震，等.五種煙草病毒TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步檢測(cè)［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（2）：146-153.

Establishment of UniversalRT-PCR System for Detection of Six Major Potato Viruses

ZHANG Wei1,BAIYanju1*,WEN Jingzhi2,FAN Guoquan1,GAO Yanling1,SHENYu1, ZHANG Shu1,MENG Xianxin3,WANG Jun4
(1.Institute of Virus-free Seedling Research,Heilongjiang Academy of AgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang 150086,China; 2.College ofAgronomy,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,Heilongjiang 150030,China;3.Institute of Crop Breeding, Heilongjiang Academy ofAgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang 150086,China;4.Beidahuang Kenfeng Seed Limited Company,Harbin,Heilongjiang 150090,China)

The higher incidence and more serious viruses in potato fields are potato virus X(PVX),potato virus Y (PVY),potato virus S(PVS),potato leafrollvirus(PLRV),potato virus M(PVM),and potato virus A(PVA),so it is very importantto guarantee the quality ofseed potato by establishmentof RT-PCRmolecular detection system with specificity, high sensitivity and fastdetection speed for these viruses.In this research,the primer for each virus was screened,PCR reagents were optimized,and annealing temperature was determined.The results indicated thatwhen the concentration of Mg2+was 2.6 mmol/L,d NTPs was 0.1 mmol/L,Taq DNA polymerase was 0.03 U/μL,and annealing temperature was 55.5℃,the reaction system was the most stable.Finally,a universalRT-PCR detection system was established,which only need to change primer for each virus when the RT-PCR detection for PVX,PVY,PVS,PLRV,PVM and PVA was needed.The detection sensitivity ofeach virus could reach the levelofpg.

potato;PVX;PVY;PVS;PLRV;PVM;PVA

S532

A

1672—3635（2015）04-0222-06

2014-12-20

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C201234）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2012ZD015）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助（CARS-10-P14）；國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2012BAD06B02-02C2）。

張威（1981-），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)。

（Corresponding author）：白艷菊，研究員，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)，E-mail：yanjubai@163.com。