王林霞等

[摘要] 目的 探討TBI患兒早期外周血HMGB1表達(dá)變化及其臨床意義。 方法 將87例急性TBI患兒根據(jù)格拉斯哥評(píng)分分成三組：嚴(yán)重組（≤8分）、中度組（9～12分）、輕度組（13～15分），分別在傷后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h采集靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)血清HMGB1含量；同時(shí)根據(jù)嚴(yán)重組患兒28 d內(nèi)是否死亡、是否發(fā)生膿毒癥或急性肺損傷分組，比較組間HMGB1的表達(dá)。 結(jié)果 重度組在各時(shí)間點(diǎn)HMGB1水平均顯著高于輕、中度組（P<0.01）；中度損傷組較輕度損傷組在6 h、12 h、24 h、48 h明顯升高（P<0.01）；死亡組患者血清HMGB1水平較存活組顯著升高（P<0.01）；發(fā)生膿毒癥及急性肺損傷病例血清HMGB1顯著均高于未發(fā)生膿毒癥及急性肺損傷病例（P<0.01）。 結(jié)論 顱腦損傷患兒早期血清HMGB1即升高，且可能作為一種“預(yù)警信號(hào)”預(yù)測(cè)損傷嚴(yán)重度及預(yù)后、并發(fā)癥的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞] 急性顱腦損傷；高遷移率族蛋白B1；兒童患者；膿毒癥；急性肺損傷

[中圖分類號(hào)] R651.15 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）22-0005-04

The changes and clinical significance of serum high mobility group box-1 protein level of childrens patients with acute traumatic brain injury

WANG Linxia TANG Luming WANG Min YAN Chunxue PAN Guoquan

Department of Pediatric Intensive Care Unit， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325027， China

[Abstract] Objective To investigate the serum high mobility group box-1 protein level of childrens patients with acute traumatic brain injury and its expression changes and clinical significance. Methods A total of 87 childrens patients with acute traumatic brain injury were randomly divided into three groups： severe group （≤8 scores）， moderate group（9 to 12 scores） and minor group（13 to 15 scores） according to the patients Glasgow Coma Scale on admission. Their venous blood were drawn at 3 h， 6 h， 12 h， 24 h， 48 h after injury and the serum HMGB1 were determined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）. The serum HMGB1 concentration were compared between different groups， survivors and non-survivors in 28 days， patients who developed acute lung injury（ALI） or sepsis and who did not develope ALI or sepsis in severe injury group. Results Compared with the minor and moderate group， the serum HMGB1 level in severe group were significantly elevated at each time points（P<0.01）. At 6 h， 12 h， 24 h， 48 h time points， the serum HMGB1 level in the moderate group increased significantly compared with the minor group（P<0.01）. The serum HMGB1 levels at 24 h after injury were higher in non-survivors compared with survivors（P<0.01）. The serum HMGB1 levels in those patients who developed acute lung injury（ALI） or sepsis were higher than who did not develope ALI or sepsis （P<0.01）. Conclusion The serum HMGB1 concentration is increased early and may be a‘a(chǎn)larm signal prognosticating prognosis and complication after acute traumatic brain injury in children.

[Key words] Acute traumatic brain injury； High mobility group box-1 protein； Children patients； Sepsis； Acute lung injury

急性創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）在兒童人群中極為常見(jiàn)，是引起兒童神經(jīng)系統(tǒng)損傷和機(jī)體功能、精神障礙的重要原因之一，具有較高的致殘率和致死率[1，2]。近年來(lái)除了強(qiáng)調(diào)原發(fā)性腦損傷外，TBI后所引起的各種繼發(fā)性損傷因素已備受關(guān)注，且認(rèn)為減少顱腦損傷后的繼發(fā)性損害能有效降低TBI患者致殘率、死亡率以及改善預(yù)后。研究表明多種因素可引起TBI后的繼發(fā)性損害，造成二次打擊，而炎癥因子的大量釋放是其中一個(gè)重要原因[3，4]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB1）是一種存在于細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白，其含量豐富，且進(jìn)化高度保守，具有調(diào)控DNA穩(wěn)定、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯等功能。研究表明，HMGB1可由受損的細(xì)胞、組織被動(dòng)釋放入血，作為一種損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMP）誘發(fā)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及分化等[5]。本研究擬根據(jù)TBI損傷嚴(yán)重程度、死亡與否及是否發(fā)生膿毒癥、急性肺損傷比較各組患兒外周血HMGB1的表達(dá)水平，初步分析及探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月～2013年12月我院急診科收治的87例急性單純顱腦外傷患兒作為研究對(duì)象，其中男45例，女42例；致傷原因包括高處墜落傷45例，車禍傷32例，擊打傷10例。入選條件：①3 h內(nèi)有明確的頭部外傷史。②年齡≤14歲。③入院時(shí)行CT等影像學(xué)檢查證實(shí)顱腦損傷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他部位嚴(yán)重?fù)p傷者。②排除既往有肺部、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及肝腎功能不全等。③損傷時(shí)間超過(guò)3 h以上。所有病例進(jìn)行常規(guī)治療，其中急診手術(shù)干預(yù)15例；急診開始進(jìn)行非手術(shù)保守治療，24 h內(nèi)顱內(nèi)病變加重需手術(shù)干預(yù)者16例；而非手術(shù)保守治療者24例。

1.2 方法

①患兒送達(dá)醫(yī)院時(shí)根據(jù)睜眼、言語(yǔ)、運(yùn)動(dòng)進(jìn)行格拉斯哥昏迷評(píng)分（Glasgow coma scale，GCS）分成三組，嚴(yán)重?fù)p傷組（8分及以下，34例）、中度損傷組（9～12分，26例）、輕度損傷組（13～15分，27例）；每例患兒分別在傷后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h靜脈采血2 mL置于干燥試管中，立即送至本院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，3 000 r/min離心20 min后取上清液，置于-80℃保存待測(cè)；嚴(yán)重?fù)p傷組每例患兒隨訪28 d，分別定期檢測(cè)血?dú)夥治觥⒀Ｒ?guī)、血壓等，分別根據(jù)急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）和膿毒癥（sepsis）診斷標(biāo)準(zhǔn)判定是否發(fā)生ALI、膿毒癥。②血清HMGB1的檢測(cè)：采用人HMGB1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（日本Shino-Test公司）檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，分別計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，將樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出HMGB1水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，用相關(guān)系數(shù)r的變化范圍判斷兩指標(biāo)間的相關(guān)程度：0為完全不相關(guān)；0.10以下為無(wú)相關(guān)；0.10～0.39為低度相關(guān)；0.40～0.69為中度相關(guān)；0.7～0.99為高度相關(guān)；1為完全相關(guān)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同損傷程度的患兒外周血HMGB1的比較

如表1所示，與輕、中度損傷組相比較，重度損傷組3 h開始HMGB1水平顯著升高（與輕度損傷組比較：t=2.386，P<0.01，與中度損傷組比較：t=1.896，P<0.01），24 h達(dá)到高峰（與輕度損傷組比較：t=4.914，P<0.01，與中度損傷組比較：t=3.836，P<0.01），48 h時(shí)開始回落；中度損傷組較輕度損傷組6 h開始升高（t=0.946，P<0.01），亦在24 h達(dá)到高峰（t=1.078，P<0.01），48 h時(shí)開始回落，提示顱腦損傷早期外周血HMGB1即開始升高，持續(xù)時(shí)間在48 h以上；24 h時(shí)間點(diǎn)HMGB1的表達(dá)與GCS評(píng)分相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.928，P<0.01），說(shuō)明顱腦損傷程度越重，其傷后24 h外周血HMGB1水平越高。

2.2 死亡組與存活組HMGB1比較

嚴(yán)重?fù)p傷組中每例患兒隨訪28 d，其中死亡14例，存活20例；采用t檢驗(yàn)比較死亡組與存活組傷后24 h血清HMGB1水平；結(jié)果如表2及圖1所示，傷后24 h血清HMGB1水平死亡組顯著高于存活組（t=23.35，P<0.01）。

2.3 是否發(fā)生膿毒癥、ALI患兒之間HMGB1比較

鑒于HMGB1作為一種炎癥介質(zhì)在膿毒癥和急性肺損傷發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[6，7]，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中比較嚴(yán)重?fù)p傷組患兒發(fā)生膿毒癥、ALI病例與未發(fā)生膿毒癥、ALI病例血清HMGB1的水平，其中15例發(fā)生膿毒癥，18例發(fā)生ALI；如圖2所示，發(fā)生膿毒癥及ALI組血清HMGB1水平顯著高于未發(fā)生膿毒癥及ALI組（是否發(fā)生膿毒癥比較：t=4.584，P<0.01，是否發(fā)生ALI比較：t=4.528，P<0.01）。

注：與未發(fā)生膿毒癥組比較*P<0.01，#與未發(fā)生ALI組比較#P<0.01

圖2 發(fā)生膿毒癥、ALI組與未發(fā)生膿毒癥、ALI組HMGB1比較

3討論

HMGB1是一種含量豐富、進(jìn)化高度保守、廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)的非組蛋白。在細(xì)胞核內(nèi)，其與DNA緊密結(jié)合，具有調(diào)控DNA穩(wěn)定、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及翻譯等功能。近年來(lái)研究表明，HMGB1可由免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌或損傷、壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放的方式轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外，并且作為一種“晚期炎癥介質(zhì)”參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[8，9]。而在嚴(yán)重外傷或缺血中，損傷早期HMGB1即升高，參與損傷后炎癥反應(yīng)的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，嚴(yán)重外傷患者30 min內(nèi)血清HMGB1即顯著升高，其與機(jī)體炎癥反應(yīng)、并發(fā)癥、預(yù)后密切相關(guān)[10]。Gu等[11]發(fā)現(xiàn)TBI大鼠傷后24 h HMGB1從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞漿，而腦組織內(nèi)蛋白及mRNA水平顯著升高。另有資料顯示，TBI患者腦脊液HMGB1濃度和血清HMGB1濃度早期明顯升高[12]，但在TBI兒童患者中尚未見(jiàn)報(bào)道。我們的資料證實(shí)，中重度TBI患兒血清HMGB1在傷后3～6 h即已經(jīng)升高，在24 h或以上達(dá)到高峰，持續(xù)48 h以上，顱腦外傷發(fā)生后，受損的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量化學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞因子，如S-100蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）、促炎因子白介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和抗炎因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等。這些化學(xué)物質(zhì)通過(guò)破壞的血腦屏障進(jìn)入血循環(huán)誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，從而造成全身組織器官的繼發(fā)性損害。因此，我們推測(cè)HMGB1作為其中的一種重要化學(xué)物質(zhì)，在TBI后其大量釋放入血循環(huán)，進(jìn)一步造成繼發(fā)性損害，而相對(duì)于其他物質(zhì)來(lái)說(shuō)，HMGB1在外周血升高更為早期，敏感度更高。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在顱腦損傷患兒中，HMGB1可能是一種良好的早期“預(yù)警信號(hào)”以判斷損傷嚴(yán)重程度、預(yù)后及并發(fā)癥的發(fā)生。

鑒于HMGB1在膿毒癥（sepsis）和急性肺損傷（ALI）的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用[6，7]，本研究資料根據(jù)TBI患兒不同預(yù)后及是否發(fā)生并發(fā)癥之間血清HMGB1比較，發(fā)現(xiàn)死亡組傷后24 h血清HMGB1較存活組顯著升高，而發(fā)生膿毒癥病例較未發(fā)生膿毒癥病例HMGB1水平高，急性肺損傷患兒較未發(fā)生ALI患兒血清HMGB1水平亦顯著升高，提示HMGB1可能與TBI患兒發(fā)生膿毒癥和ALI密切相關(guān)。既往研究表明，HMGB1作為一種重要炎性介質(zhì)，其可以與細(xì)胞表面受體——糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation endoproducts receptors， RAGE）、Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)通路，誘發(fā)其他炎性介質(zhì)的大量產(chǎn)生，同時(shí)這些炎癥介質(zhì)亦可誘導(dǎo)HMGB1的生成，形成炎癥因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[13，14]。在TBI大鼠模型中發(fā)現(xiàn)血清HMGB1升高的同時(shí)，其相應(yīng)受體RAGE、TLR4和核因子NF-κB表達(dá)顯著升高，相應(yīng)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α升高，而甘草甜素（glycyrrhizin）的干預(yù)能夠抑制HMGB1的產(chǎn)生和RAGE、TLR4的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)及腦水腫程度[11]。Okuma等[15]采用HMGB1單克隆抗體治療TBI大鼠，發(fā)現(xiàn)其可以抑制HMGB1的轉(zhuǎn)移，保護(hù)血腦屏障的完整性以及降低炎癥反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，HMGB1對(duì)機(jī)體具有雙重作用，即中低濃度的HMGB1對(duì)宿主反應(yīng)是有益的，能夠限制炎癥或組織損傷進(jìn)展，促進(jìn)損傷修復(fù)和組織再生；隨著HMGB1劑量蓄積及作用時(shí)間的延長(zhǎng)則導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，促使原有損傷進(jìn)一步惡化甚至出現(xiàn)廣泛組織損害和器官衰竭。而我們的研究結(jié)果提示HMGB1的大量分泌可能是顱腦損傷后誘發(fā)炎癥反應(yīng)、造成繼發(fā)性損傷的啟動(dòng)因素之一，而針對(duì)于HMGB1的干預(yù)可能有利于減輕炎癥反應(yīng)，減少并發(fā)癥的發(fā)生，改善預(yù)后。

綜上所述，我們的資料證實(shí)顱腦損傷患兒早期血清HMGB1即升高，且能一定程度上判斷患兒的預(yù)后及并發(fā)癥的發(fā)生，同時(shí)提示針對(duì)HMGB1的靶向干預(yù)治療可能可以減輕TBI患兒的繼發(fā)性損害及并發(fā)癥的發(fā)生。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Keenan HT，Bratton SL. Epidemialogy and outcomes of pediatric traumatic brain injury[J]. Dev Neurosci，2006，28：256-263.

[2] 王振芳，梁秀清，王曉紅，等. 高壓氧綜合治療兒童顱腦損傷并發(fā)運(yùn)動(dòng)障礙32例療效觀察[J]. 中華航海醫(yī)學(xué)與高氣壓醫(yī)學(xué)雜志，2013，20（4）：267-268.

[3] 賈進(jìn)明，姜雪峰，周建良，等. 急性中、重度顱腦損傷伴全身炎癥反應(yīng)綜合征的臨床分析[J]. 中華神經(jīng)外科雜志，2012，9（1）：42-43.

[4] 齊向前，于明琨. 顱腦損傷后炎癥反應(yīng)與腦水腫[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，6（8）：850-852.

[5] Abraham E. Unraveling the role of highmobilitygroupboxprotein1 in severe trauma[J]. Crit Care，2009，13（6）：1004.

[6] Waterer GW. High-mobility group box 1（HMGB1） as a potential therapeutic target in sepsis-more questions than answers[J]. Crit Care Med，2007，35（4）：1205-1206.

[7] Abraham E，Arcaroli J，Carmody A，et al. HMG-1 as a mediator of acute lung inflammation[J]. J Immunol，2000， 165（6）：2950-2954.

[8] Wang H，Yang H，Czura Wang H，et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science，1999， 285（5425）：248-251.

[9] 徐海洲，何建. HMGB1與臨床疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)急救醫(yī)學(xué)，2011，32（3）：264-268.

[10] Cohen MJ，Brohi K，Calfee CS，et al. Early release of high mobility group box nuclear protein 1 after severe trauma in humans： role of injury severity and tissue hypoperfusion[J]. Crit Care，2009，13（6）：R174.

[11] Gu XJ，Xu J，Ma BY，et al. Effect of glycyrrhizin on traumatic brain injury in rats and its mechanism[J]. Chin J Traumatol，2014，17（1）：1-7.

[12] 張?chǎng)H鵬，劉德昭. 急性顱腦損傷患者血清及腦脊液HMGB1的表達(dá)及臨床意義[J]. 臨床醫(yī)學(xué)工程，2012，19（2）：37-39.

[13] 湯魯明，盧中秋，姚詠明. 高遷移率族蛋白B1的胞外作用與免疫效應(yīng)[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展，2011，42（3）：188-194.

[14] Huang WC，Tang YQ，Li L. HMGB1，a potent proinflammatory cytokine in sepsis[J]. Cytokine，2010，51（2）：119-126.

[15] Okuma Y，Liu K，Wake H，et al. Anti-high mobility group box-1 antibody therapy for traumatic brain injury[J]. Ann Neurol，2012，72（3）：373-384.

（收稿日期：2015-01-16）