閻賀靜，時 月，劉 暢，李潤豐（河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 昌黎 066600）

一株野生釀酒酵母的分離鑒定及發(fā)酵分析

閻賀靜，時 月，劉 暢，李潤豐
（河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 昌黎 066600）

本試驗從玫瑰香葡萄酒自然釀造過程中篩選分離出一株野生酵母菌，經(jīng)菌落形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定為釀酒酵母，命名為Yeast1。對Yeast1進行乙醇耐受性分析，發(fā)現(xiàn)Yeast1能夠耐受16%（v/v）的酒精度。Yeast1發(fā)酵葡萄汁結(jié)束后，殘?zhí)橇俊⒕凭?、揮發(fā)酸、總酯和總酸含量分別為3.627 011 g/L、8.5%、0.210 84 g/L、1.264 4 g/L和4.160 3 g/L，分析表明Yeast1發(fā)酵力強、速度快、酒精產(chǎn)量較高，殘?zhí)橇糠厢勗旄尚途频囊螅瑵M足正常的發(fā)酵需要。此外，從Yeast1葡萄汁發(fā)酵液中共檢測到50種香氣成分，其中醇類18種、酯類13種、醛類7種、其他酸烯酮醚等物質(zhì)12種。研究結(jié)果表明，昌黎產(chǎn)地玫瑰香葡萄自然釀造中存在較好性能的天然酵母，若將其合理利用可能會釀造出更優(yōu)質(zhì)、更具特色的葡萄酒。

玫瑰香葡萄酒；野生酵母；分離；鑒定；發(fā)酵分析

葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)主要來自于葡萄和酵母酒精發(fā)酵過程。優(yōu)質(zhì)的葡萄酒應(yīng)該具有突出的地域特色和品種香氣。據(jù)文獻［1］報道，不同生態(tài)因子和不同酵母菌種對地域特色葡萄酒的風(fēng)格形成有重要影響。由傳統(tǒng)葡萄和葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離獲得的釀酒酵母具有產(chǎn)區(qū)地域特色，對于釀制地域特色葡萄酒是非常有必要的。

酵母菌是葡萄酒釀造的生命之源，葡萄酒的品質(zhì)與其有著密不可分的關(guān)系。很多研究工作者和葡萄酒生產(chǎn)商都在從事特色產(chǎn)區(qū)酵母的選育工作，以獲得良好的菌種，釀造具有地域風(fēng)格和典型性的優(yōu)質(zhì)葡萄酒［2-4］。昌黎是我國主要的玫瑰香葡萄產(chǎn)地之一，由玫瑰香釀造的玫瑰型葡萄酒口味清爽優(yōu)雅，具有迷人的玫瑰香氣，果味突出，具有明顯的品種特征。為了釀制具有地域特色和品種香氣的優(yōu)質(zhì)玫瑰香葡萄酒，使用產(chǎn)區(qū)分離獲得的酵母非常有必要。本研究擬從玫瑰香葡萄酒自然釀造過程中分離優(yōu)勢酵母，并對其發(fā)酵特性進行分析，確定其葡萄酒釀造特性，為具有產(chǎn)地和品質(zhì)特色的玫瑰香葡萄酒釀造提供適宜的酵母種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

試驗中所用玫瑰香葡萄采摘自河北省昌黎縣葡萄溝，葡萄樣品去除生青、霉爛果和枯枝爛葉后，去除果梗、用手破碎用于葡萄酒的自然發(fā)酵。其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-2D型凈化工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌鍋:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-C空氣浴振蕩器:哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；OLYMPUS顯微鏡CX319:日本奧林巴斯公司；V1型全自動菌落計數(shù)儀:杭州迅數(shù)科技有限公司；PCR擴增儀（TaKaRa Thermal Cycler Dice TP600，TaKaRa BIO INC）；ImageMster VDS電泳成像裝置（Pharmacia Biotech）；ABI PRISMTM3730XL DNA Sequencer DNA測序儀（Applied Biosystem）。

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基配置中用水均為蒸餾水。

1.3.1 YPD培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，YEPD固體培養(yǎng)基中添加瓊脂20 g/L。（在以上兩種培養(yǎng)基即YPD和YEPD中分別加入100 mg/L氨芐青霉素抑制細菌生長）。

1.3.2 WL培養(yǎng)基 葡萄糖50 g/L，瓊脂20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母浸粉4 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，氯化鐵0.025 g/L，硫酸錳0.002 5 g/L，溴甲酚綠0.022 g/L，調(diào)pH值至6.0。

1.3.3 豆芽汁培養(yǎng)基 將10%的鮮豆芽煮沸30 min，過濾后取清液添加葡萄糖50 g/L，自然pH。

1.3.4 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g/L，煮沸30 min后過濾，取清液添加蔗糖20 g/L、瓊脂20 g/L，自然pH。

1.3.5 產(chǎn)酯培養(yǎng)基［5］少量水將15 g玉米粉調(diào)成糊狀，然后逐漸加水至250 mL，攪拌均勻，然后在80～90℃的水浴里保持1.5 h，期間攪拌3～4次，然后過濾，將濾液補足至250 mL，加5 g瓊脂，加熱融化后趁熱用脫脂棉過濾，121℃滅菌30 min。

1.3.6 發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基 將10%的鮮豆芽煮沸30 min，過濾后取清液添加葡萄糖50 g/L，自然pH。

1.4 研究方法

1.4.1 玫瑰香葡萄自然釀造過程中酵母菌的分離純化 將玫瑰香葡萄按自然發(fā)酵進行酒精發(fā)酵，將發(fā)酵過程分為前中后3個時期并分別取樣1mL，樣品梯度稀釋后涂布于YEPD培養(yǎng)基，在28℃條件下培養(yǎng)2～3 d，從適宜稀釋度平皿中挑取全部酵母菌落，轉(zhuǎn)接到WL鑒別培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5～7 d，對不同形態(tài)的酵母菌進行計數(shù)，以確定不同時期各菌株的數(shù)量，另挑取長勢優(yōu)良的菌株進行劃線分離，進一步純培養(yǎng)，獲得單菌落酵母菌，保藏PDA斜面培養(yǎng)基，備用。

1.4.2 酵母菌的初步分類鑒定 將1.4.1中所得單菌落酵母菌劃線接種在WL鑒別培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5～7 d，觀察記錄菌落特征，并根據(jù)其特征以及顯微觀察進行初步鑒定。

1.4.3 酵母菌分子鑒定 酵母菌26s rDNA擴增及序列測定由寶生物工程（大連）有限公司受托解析并完成。

1.4.4 酵母的發(fā)酵特性分析

（1）酵母的乙醇耐受性測定

將滅菌后的YPD瓊脂培養(yǎng)基降溫至50℃，按10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、24%、26%體積分數(shù)加入乙醇，接種新鮮酵母菌，在YPD固體平板進行生長實驗［6］。28℃培養(yǎng)1周后，觀察培養(yǎng)基表面是否形成醭、環(huán)或島。用陽性（+）表示形成，陰性（-）表示不形成。如果同一水平重復(fù)試驗中有極少數(shù)形成，用弱陽性（+-）表示。與此同時用葡萄酒活性干酵母作對照。

（2）葡萄汁發(fā)酵實驗

將酵母菌接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，28℃條件下180 r/min震蕩培養(yǎng)18 h，在10℃條件下10 000 r/min離心3 min，收集菌體備用。

選擇玫瑰香葡萄汁進行發(fā)酵實驗，調(diào)整糖度21%，500 mL三角瓶分裝120 mL葡萄汁滅菌，按0.2 g/L的接種量添加酵母，在18℃條件下發(fā)酵。每24 h測定還原糖，待發(fā)酵結(jié)束即殘?zhí)橇吭? g/L以下，測定發(fā)酵液的酒度、總酸、揮發(fā)酸以及香氣。期間取樣均在無菌操作條件下進行。

（3）酵母產(chǎn)酯能力測定

用平板劃線法將酵母在無菌條件下接種至產(chǎn)酯培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2～3 d，通過嗅覺初步判定是否產(chǎn)生酯香。

另通過發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵液總酯量:將活化好的菌種接種到發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基中，接種量為4%，在28℃條件下180 r/min恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)3～4 d后取樣，采用皂化中和滴定法測總酯量［7］。

（4）香氣成分的檢測

葡萄發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵醪200 mL，經(jīng)高速冷凍離心機10 000 r/min，離心15 min，取清汁貯藏在-18℃的冰柜中備用。在香氣提取時從冰柜中取出葡萄酒樣品，在30℃的水浴中解凍。取100 mL葡萄酒樣以2 mL/min的流速通過XAD-2樹脂柱，用100 mL蒸餾水洗柱，除去糖、酸及其他一些水溶性化合物。再用100 mL的戊烷:乙醚（體積比1∶1）以2 mL/min的流速洗脫吸附在柱上的游離態(tài)芳香物質(zhì)，然后用分液漏斗將洗脫液有機相和水相分離。在有機相中加入烘干的無水Na2SO4，4℃放置4 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至3 mL，通過GC-MS分析［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰香葡萄自然釀造過程中酵母菌的初步鑒定

WL培養(yǎng)基是酒類發(fā)酵過程中微生物類群鑒別培養(yǎng)基。葡萄酒自然發(fā)酵過程中大多數(shù)典型酵母菌都可以用WL培養(yǎng)基進行區(qū)分。不同種類的酵母菌在WL培養(yǎng)基上生長的菌落顏色和形態(tài)一般不同［9］?；诖嗽俳Y(jié)合顯微鏡下酵母菌細胞形態(tài)的特點，可以將酵母菌進行初步聚類。在玫瑰香葡萄自然發(fā)酵過程前、中、后3個時期分別分離得到75株、139株和123株酵母菌。從中分離獲得1株酵母菌記為Yeast1，其菌株的菌落形態(tài)為奶油白色，帶綠色，表面光滑，不透明，邊緣整齊，球型凸出。在10×100放大倍數(shù)下單細胞形態(tài)為橢圓形，如圖1所示。

圖1 酵母菌Yeast1在WL培養(yǎng)基上的菌落特征及細胞形態(tài)Fig.1 Colonies and morphological characteristics of strain Yeast1 on WL medium

根據(jù)CAVAZZA等［10］和PALLMANN等［11］描述的不同釀酒酵母在WL培養(yǎng)基上的特征，可初步判斷酵母菌Yeast1為釀酒酵母。

2.2 酵母菌Yeast1分子鑒定結(jié)果

通過形態(tài)鑒定只能對菌株進行初步鑒定，為了得到Y(jié)east1種屬的確切信息，需要借助分子生物學(xué)的手段。將Yeast1的26s rDNA D1/D2區(qū)序列進行PCR擴增、測序，擴增結(jié)果見圖2。

圖2 酵母Yeast1 PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR results of strain Yeast1

由圖2可知，Yeast1的26s rDNA D1/D2區(qū)序列長度為558 bp。將其在NCBI中進行比對，對比結(jié)果顯示與S.cerevisiae的基因庫接受號KM055472.1的同源性達到100%，由此可以確定Yeast1為釀酒酵母，此結(jié)果與WL培養(yǎng)基初步鑒定結(jié)果一致。

2.3 酵母的發(fā)酵特性

2.3.1 酵母Yeast1的乙醇耐受性 酵母菌的乙醇耐受性關(guān)系到乙醇得率，同時也是其是否有良好發(fā)酵性能的判定標準之一。在葡萄酒釀造過程中，乙醇不斷積累，高濃度的乙醇會對酵母細胞產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致菌體細胞無法正常生長，使生長速度減緩甚至死亡。因此，了解酵母的乙醇耐受性非常必要，并能更好地了解掌控葡萄酒發(fā)酵過程。對酵母菌Yeast1的乙醇耐受性進行了測定，結(jié)果如表1所示。

表1 酵母菌Yeast1乙醇耐受性Tab.1 Ethanol tolerance of strain Yeast1

由表1可知，酵母菌Yeast1有較高的耐受性，基本可以耐受16%的乙醇濃度，隨著乙醇濃度的變化，活菌數(shù)量呈階梯式變化。由此可見，Yeast1具有很好的乙醇耐受性，可以滿足正常的發(fā)酵需要。

2.3.2 酵母Yeast1葡萄汁發(fā)酵特性 以殘?zhí)橇?、酒精度、揮發(fā)酸及總酸為指標，測定酵母Yeast1在葡萄汁中的發(fā)酵性能，結(jié)果如表2和圖3所示。

表2 Yeast1葡萄汁發(fā)酵能力檢測Tab.2 Fermentation ability of Yeastl in grape wine juice

菌株消耗還原糖能力是檢測其發(fā)酵能力的必要內(nèi)容之一。由圖3可見，酵母Yeast1發(fā)酵初始階段對還原糖的消耗較快，發(fā)酵第4天殘?zhí)沁_到60 g/L以下，從第4天開始還原糖消耗速度漸緩，發(fā)酵結(jié)束后最終殘?zhí)橇繛?.627 011 g/L（見表2），符合干型葡萄酒的殘?zhí)呛? g/L以下的釀造要求。發(fā)酵完成后的酒精度為8.5%（v/v）（見表2），該酒精度與一些文獻報道的酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒精度相比略低［12-14］。綜合Yeast1發(fā)酵糖的速度及發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)呛浚f明酵母Yeast1發(fā)酵力強，發(fā)酵速度快，產(chǎn)酒精量較高，殘?zhí)橇糠厢勗旄尚途频囊蟆?/p>

圖3 葡萄汁發(fā)酵過程中還原糖的變化曲線Fig.3 Curve of reducing sugar content during the fermentation

國標中對葡萄酒的揮發(fā)酸含量有明確規(guī)定，其含量應(yīng)小于1.2 g/L，若揮發(fā)酸含量過高則會影響酒質(zhì)。酵母Yeast1發(fā)酵完成后揮發(fā)酸含量為0.210 84 g/L（見表2），符合葡萄酒釀造中國標對這一指標的要求，且含量保持在較低的水平。

酸度對葡萄酒的風(fēng)味影響較大，也可以防止酒氧化使色澤穩(wěn)定，對細菌也有抑制作用。而不同酵母菌的合成代謝有明顯區(qū)別，這就使得到的有機酸成分及含量各不相同，從而影響了最終發(fā)酵液的總酸含量。酵母菌Yeast1發(fā)酵完成后發(fā)酵液的總酸含量為4.160 3 g/L（見表2）。GB 15037-2006中未對總酸做嚴格要求，其總酸與總糖的差值在2.0 g/L及以下即可，因此對照表2的數(shù)據(jù)分析可知酵母Yeast1符合釀造要求［15］。

2.3.3 酵母產(chǎn)酯能力分析 為了提高葡萄酒的品質(zhì)，生香酵母的選育是重要內(nèi)容，酵母菌對最初酒體香氣的形成有著重要意義。菌種的差異可以改變對香氣形成的前體物質(zhì)的作用效果，使最終酵母菌中的糖苷酶代謝產(chǎn)生香氣的種類和含量也大有不同［16］。因此，對篩選菌種進行產(chǎn)酯能力的測定甚為必要。將Yeast1接種到產(chǎn)酯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過嗅覺初步判斷有明顯的酯香，發(fā)酵實驗及皂化中和滴定測得的總酯含量為1.264 4 g/L，由此表明Yeast1具有突出的生香效果，可以在一定程度上豐富葡萄酒香氣物質(zhì)種類，增加酯類成分含量，這對于釀造風(fēng)格獨特、高品質(zhì)的具有地域特色的葡萄酒有重要意義。

2.3.4 酵母Yeast1發(fā)酵酒樣中香氣成分 葡萄酒最初的發(fā)酵香主要來源于酒精發(fā)酵，而參與酒精發(fā)酵最主要的則屬酵母菌，釀酒酵母和非釀酒酵母均起著重要作用。酵母菌的活動與香氣的形成及修飾密不可分，相關(guān)研究表明不同酵母的生理活性及代謝過程不同，因此對風(fēng)味物質(zhì)形成的作用效果也存在差異性［17-18］。所以，有必要了解Yeast1的發(fā)酵液香氣成分，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酵母菌Yeast1發(fā)酵液香氣成分GC-MS總離子圖Fig.4 GC-MS analysis on aroma components in Yeast1 fermentation broth

對圖4所得總離子圖進行分析，Yeast1發(fā)酵液中共檢測出50種香氣成分。在所有檢測出的化合物中有醇類18種、酯類13種、醛類7種、其他酸烯酮醚等物質(zhì)12種，相對百分含量分別為32.07%、5.99%、0.66%和3.74%。其中，醇類物質(zhì)中相對含量較高的有異戊醇（17.21%）、苯乙醇（4.81%）、2-環(huán)-己烯醇（2.84%）、異丁醇（1.87%）、十六醇（1.82%）、芳樟醇（1.5%）。葡萄酒中的醇類物質(zhì)主要來自于乙醇發(fā)酵過程，主要由氨基酸和亞麻酸轉(zhuǎn)化而來。本試驗檢測到的苯乙醇具有玫瑰花香、薔薇、茉莉、丁香及花粉味，是玫瑰香葡萄的特征香氣。

葡萄酒中的酯類物質(zhì)主要來自于葡萄漿果果皮、酒精發(fā)酵和后期儲藏過程。在Yeast1發(fā)酵液總共檢測到酯類物質(zhì)13種，相對含量較高的有草酸二異丁酯（1.79%）、辛酸甲酯（1.03%）、己酸烯丙酯（1.00%）、乙酸乙酯（0.82%）、乙酸香葉酯（0.38%）、安息香酸乙酯（0.33%）。本次檢測到相對含量最高的酯類為草酸二異丁酯和辛酸甲酯。其中，辛酸甲酯具有青蘋果、果香、草莓香、茴香香味；乙酸乙酯的相對含量也較高，具有果香、青蘋果、香蕉和白蘭地味。這些物質(zhì)對葡萄酒的香氣均有積極作用。

Yeast1發(fā)酵液中醛類物質(zhì)相對含量較高的有檸檬醛（0.45%）；酮類物質(zhì)相對含量較高的有4-羥基-2-丁酮（0.88%）、鳶尾酮（0.98%）；酸類物質(zhì)中月桂酸相對含量較高（1.05%）。

3 結(jié)論

本試驗從玫瑰香葡萄自然發(fā)酵中分離到1株酵母菌記為Yeast1，分子鑒定為釀酒酵母。Yeast1酵母發(fā)酵力強，發(fā)酵速度快，產(chǎn)酒精量較高，殘?zhí)橇糠厢勗旄尚途频囊?。同時具有很好的乙醇耐受性和良好的產(chǎn)酯能力，可以滿足正常的發(fā)酵需要。從Yeast1發(fā)酵液中共檢測到50種香氣成分，其中醇類18種、酯類13種、醛類7種、其他酸烯酮醚等物質(zhì)12種。綜上，昌黎產(chǎn)地玫瑰香葡萄自然釀造中存在較好性能的天然酵母，若將其合理利用可能會釀造出更優(yōu)質(zhì)、更具特色的葡萄酒，但還需大量研究工作來證實，本試驗結(jié)果可以為今后的研究工作提供相關(guān)理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯:胡燕梅）

Isolation，Identification and Fermentation Analysis of a Wild Saccharomyces Cerevisiae

YAN Hejing，SHI Yue，LIU Chang，LI Runfeng
（College of Food Science and Technology，Hebei Normal University of Science and Technology，Changli 066600，Hebei，China）

In this experiment，one Saccharomyces cerevisiae was screened and identified from Muscat wine natural brewing broth with morphological method and molecular technology，which was named as Yeast1.Firstly，Yeast1 could tolerate 16%（v/v）ethanol.Moreover，after the fermentation of grape juice by Yeast1，the content of residual sugar，of ethanol，of volatile acid，of total ester and of total acid were 3.627 011g/L、8.5%、0.210 84g/L、1.264 4g/L and 4.160 3g/L，respectively.These results indicated that Yeast1 has better fermentation ability，and can initiate the fermentation immediately and produce a higher content of ethanol.At the same time，the residual sugar in Yeast1 fermentation broth fit the standard for dry wine production.Furthermore，there are 50 kinds of aroma compounds were detected by GC-MS in Yeast1 fermentation broth，of which，there are 18 kinds of alcohol compounds，13 kinds of ester compounds，7 kinds of aldehyde compounds and other 12 kinds of compounds like acids，ketene and ether，and so on.These results indicated that there are yeasts with good fermentation properties in muscat wine natural process in Changli district，which maybe produce better wines in quality and characteristic if they were used appropriately.

muscat grapes wine；natural yeast；isolation；identification；fermentation analysis

Q93.3；TS261.11；TS262.61

A

1673-0143（2015）05-0454-06

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.05.015

2015-06-23

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（QN2014143）；河北科技師范學(xué)院博士研究啟動基金資助項目

閻賀靜（1978—），女，副教授，博士，研究方向：發(fā)酵工程。