鄧威

摘 要：天津市寧河縣某淡水養(yǎng)殖池塘發(fā)生了一起草魚細(xì)菌性疾病?；疾〔蒴~出現(xiàn)腹部充血，腹腔積水和肝臟發(fā)白等癥狀。從患病草魚肝臟中分離到PA001和PA002兩個(gè)菌株，通過回感試驗(yàn)證明這兩個(gè)菌株可能為引發(fā)該疾病的病原菌，經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌。根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，采用口服氟苯尼考的方法進(jìn)行治療，取得了較好的效果。

關(guān)鍵詞：銅綠假單胞菌；感染；草魚；鑒定

中圖分類號(hào)：S941 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.014

Identification and Isolation of Bacterial Pathogens from Bacterial Disease of Grass Carp

DENG Wei

（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals， Tianjin 300221，China）

Abstract： An epizootic was discovered in grass carp （Ctenopharyngodonidellus） in earthen ponds in Ninghe. The diseased fish presented with hemorrhaging in the abdominal wall， ascites in the abdomen and pale liver. Strains named PA001 and PA002 were isolated from the moribund fish， and were identified as Pseudomonas aeruginosa according to biochemical tests. The pathogenicity of PA001 was confirmed by infectivity experiments. According to the result of antimicrobial susceptibility testing， florfenicol were used by oral administration， and the result showed that it was an effective measure to control the disease.

Key words： Pseudomonas aeruginosa； infection； grass carp； identification

假單胞菌是魚類“赤皮病”的病原菌，該病對(duì)淡水養(yǎng)殖魚類危害嚴(yán)重，常引起較大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在假單胞菌屬之中，熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、綠針假單胞菌和變形假單胞菌都能導(dǎo)致魚類的病害發(fā)生[2-5]。然而，有關(guān)銅綠假單胞菌能引發(fā)魚類疾病的報(bào)道卻很少見，盡管其常作為一種人類病原被報(bào)道。本研究報(bào)道了一例由銅綠假單胞菌引發(fā)的草魚疾病。

1 材料和方法

1.1 病原菌的分離

2013年5月8日，10尾患病草魚從天津市寧河縣某養(yǎng)殖場(chǎng)送至本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷。通過鏡檢草魚的鰓和體表，未發(fā)現(xiàn)大量的寄生蟲。在無菌操作下，從瀕死草魚的腎臟、肝臟和脾臟取樣，在LB培養(yǎng)平板上分離病原菌，28 °C培養(yǎng)24 h 后，選取優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步分離純化，分離得到兩株優(yōu)勢(shì)菌株P(guān)A001和PA002。

1.2 細(xì)菌的鑒定

菌株P(guān)A001和PA002的形態(tài)、生理生化特性按文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行鑒定。同時(shí)利用法國梅里埃公司的半自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。

1.3 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)草魚由天津市換新良種場(chǎng)提供，共60尾，體長（12±2.1） cm。草魚飼養(yǎng)于50 L的圓形塑料桶中，充氣，每天按體質(zhì)量的2%投喂膨化飼料，上下午各投喂1次。暫養(yǎng)2周，確認(rèn)無病后，開始試驗(yàn)。將PA001用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，5 000 g離心集菌，用PBS洗滌3次后，用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕簼舛日{(diào)整為1.0×107 CFU·mL-1，腹腔注射草魚0.2 mL，對(duì)照組注射同樣劑量的PBS，連續(xù)觀察2周。

1.4 藥敏試驗(yàn)

28 °C培養(yǎng)過夜的PA001用PBS調(diào)整濃度至1×108 CFU·mL-1，取100 μL涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板，然后將藥敏紙片（購于杭州微生物公司）貼在平板上，28 °C培養(yǎng)24 h 后測(cè)定抑菌直徑，按照產(chǎn)品說明書判斷敏感度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

PA001和PA002呈現(xiàn)相同的生理生化特征，為革蘭氏陰性桿菌，具有運(yùn)動(dòng)性，不產(chǎn)生孢子。在LB平板上28 °C培養(yǎng)48 h后，菌落成圓形，濕潤，邊緣整齊，不透明，淡黃色，菌落直徑約為2～2.5 mm。同時(shí)，在血平板上，兩株細(xì)菌都具有β溶血，其他生化反應(yīng)與銅綠假單胞菌ATCC 27853株具有相同的結(jié)果（表1），因此，根據(jù)常規(guī)生理生化測(cè)試可初步判定為銅綠假單胞菌。

利用ATB鑒定系統(tǒng)對(duì)PA001和PA002進(jìn)行鑒定，兩株細(xì)菌顯示完全相同的鑒定結(jié)果，都顯示為銅綠假單胞菌（表2）。

2.2 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)組草魚在感染后第5天出現(xiàn)死亡，至14 d，累計(jì)死亡率為67%。人工感染后試驗(yàn)魚表現(xiàn)為活動(dòng)減弱，腹部充血，腹腔有積水，個(gè)別死亡魚眼球突出。死魚解剖檢查，可見肝臟發(fā)白，同自然發(fā)病的癥狀基本相似，對(duì)照組不表現(xiàn)任何癥狀。從感染后的病魚肝臟中再次分離細(xì)菌，用優(yōu)勢(shì)菌PA001-1再次感染草魚，得到相同的結(jié)果。

2.3 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)菌株P(guān)A001對(duì)12種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，該菌株對(duì)妥布霉素、四環(huán)素和氟苯尼考等3種抗生素敏感，對(duì)鏈霉素、氯霉素和慶大霉素等3種抗生素中度敏感，對(duì)諾氟沙星、氨芐青霉素、紅霉素、羅紅霉素、卡拉霉素和萬古霉素等6種抗生素顯示出耐藥（表3）。

3 結(jié)論與討論

草魚是我國的四大家魚之一，年產(chǎn)量達(dá)229.7萬t[7]。然而，由于集約化程度和養(yǎng)殖密度的不斷提高，草魚病害也日漸增多。據(jù)報(bào)道，熒光假單胞菌[5]、柱狀黃桿菌[8]、嗜水氣單胞菌[9]、霍亂弧菌[6]和擬態(tài)弧菌[6]都曾引起草原細(xì)菌性病害的暴發(fā)。本試驗(yàn)中，銅綠假單胞菌從患病草魚肝臟中被分離到，且通過攻毒試驗(yàn)證明其對(duì)草魚的致病性，這說明銅綠假單胞菌是引起此次草魚疾病的病原。然而，由于能對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)生拮抗作用，為了控制嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥，銅綠假單胞被作為一種益生素用于鯪魚的養(yǎng)殖。由于銅綠假單胞菌對(duì)草魚的致病性，它作為益生素使用的安全性應(yīng)給予高度的重視。

此次疾病流行了1個(gè)月，導(dǎo)致了超過30%的草魚死亡，根據(jù)藥物敏感性的試驗(yàn)結(jié)果，利用口服氟苯尼考（每尾魚25 mg·kg-1·d-1）的方法對(duì)草魚進(jìn)行治療，3 d后病害得到控制，1周后草魚停止死亡，這表明藥物敏感性試驗(yàn)在治療藥物篩選過程中具有很強(qiáng)的實(shí)際意義。所以，在今后的生產(chǎn)實(shí)踐中，應(yīng)根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，做到科學(xué)合理地選擇和使用藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1] Wang H R， Hu Y H， Zhang W W， et al. Construction of an attenuated Pseudomonas fluorescens strain and evaluation of its potential as a cross-protective Vaccine[J]. Vaccine， 2009， 27： 4 047-4 055.

[2] Altinok I， Balta F， Capkin E， et al. Disease of rainbow trout causedby Pseudomonas luteola[J]. Aquaculture， 2007， 273： 393-397.

[3] Altinok I， Kayis S， Capkin E. Pseudomonas putida infection in rainbow trout[J]. Aquaculture， 2006， 261： 850-855.

[4] Aly S M， Abdel-Galil Ahmed Y， Abdel-Aziz Ghareeb A， et al. Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus， as potential probiotics， on the immune response and resistance of Tilapia nilotica （Oreochromis niloticus） to challenge infections[J]. Fish and Shellfish Immunology， 2008， 25：128-136.

[5] 耿曉修，丁詩華，孫翰昌，等.熒光假單胞菌滅活疫苗對(duì)草魚的免疫保護(hù)效應(yīng)[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，28：120-123.

[6] 東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[7] 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.中國漁業(yè)年鑒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

[8] 王良發(fā)，謝海俠，張金，等. 我國淡水魚類柱形病病原菌柱狀黃桿菌的遺傳多樣性[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2010，34（2）：367-377.

[9] Song X H， Zhao J， Bo Y X， et al. Aeromonas hydrophila induces intestinal inflammation in grass carp （Ctenopharyngodon idella）： An experimental model[J]. Aquaculture， 2014， 434： 171-178.

[10] 李楠，郭慧芝，焦冉，等. 草魚的一種急性細(xì)菌性傳染病病原的分離鑒定及致病性研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2011，35（6）：980-987

[11] Zhang Y Q， Zhang T T， Li J N， et al. Design and evaluation of a tandemly arranged outer membrane protein U （OmpU） multi-epitope as a potential vaccine antigen against Vibrio mimicus in grass carps （Ctenopharyngodon idella）[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2014，160：61-69.