肖宇 曹寶山 梁莉

肺癌目前是全球發(fā)病率第一位的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占肺癌的80%[1]，確診時約75%的NSCLC患者處于進(jìn)展期，大多數(shù)進(jìn)展期NSCLC患者5年生存率不足5%[2]。過去20年里，隨著化療新藥（如紫杉類藥物、培美曲塞、吉西他濱等）、針對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變的靶向藥物（如吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺岷桶⒎ㄌ婺岬龋┮约搬槍﹂g變淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因易位的靶向藥物（如克唑替尼）的出現(xiàn)，進(jìn)展期肺癌患者的生存得到了明顯改善，患者中位無進(jìn)展生存期達(dá)到8個月-12個月[3-9]，但仍不能治愈。因此，尋找新的藥物和新的治療手段非常必要。

尼妥珠單抗是一針對EGFR人源化的IgG1型單克隆抗體，在多種腫瘤中其可以提高化療和放療的敏感性，并可逆轉(zhuǎn)耐藥[10-15]。在與放療聯(lián)合時，尼妥珠單抗通過使腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，進(jìn)而提高腫瘤的放射敏感性[13]。目前NSCLC常用化療藥物包括培美曲塞、吉西他濱、紫杉類、長春堿類、鉑類藥物多種，這些藥物作用于腫瘤細(xì)胞的周期并不相同，尼妥珠單抗對這些藥物的敏感性尚缺乏報道。因此，探討尼妥珠單抗與這些藥物聯(lián)合對NSCLC的影響及其機(jī)制，對于優(yōu)化治療方案、提高療效、減輕毒性和降低患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)尤為重要。本研究通過體外實驗，以PC9細(xì)胞為觀察對象，探討尼妥珠單抗同NSCLC中常用化療藥物聯(lián)合對PC9細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的影響，并分析可能機(jī)制，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 PC9細(xì)胞株來自北京腫瘤醫(yī)院基礎(chǔ)實驗室；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶、無酚紅HBSS緩沖鹽均購于Gibco?公司；赫斯特?zé)晒馊玖?3342（Hochest 33342）、碘化吡啶（PI）、N-（2-羥乙基）哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）購于Sigma-aldrich?公司；順鉑注射液（5 mg/mL）購于云南個舊生物藥業(yè)有限公司，培美曲塞（100 mg/支）及吉西他濱（200 mg/支）購于美國禮來公司，紫杉醇（30 mg/支）購于美國施貴寶公司，長春瑞濱（10 mg/支）購于皮爾法伯公司；兔抗-微管蛋白（Tublin）購于Abcam?公司；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）購于Cytoskeleton?公司；FITC-抗兔二抗購于Santa Cruz?公司。WST-1增殖試劑盒購于Roche?公司（美國）。96孔板（Costar?公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC9細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底80%-90%時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 藥敏試驗 ①5×103，12 h后加藥。分成空白對照、順鉑、吉西他濱、培美曲塞、紫杉醇、長春瑞濱6組?；熕幬餄舛纫来螢椋?.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL、1,000 μg/mL。加藥24 h后利用WST-1增殖檢測試劑盒按照說明進(jìn)行檢測，分別計算藥物的半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration,IC50）值。②根據(jù)藥物的IC50值，每種藥物選低于IC50值的1個濃度，分別設(shè)化療組和化療藥+尼妥珠單抗聯(lián)合組，尼妥珠單抗?jié)舛仍O(shè)定為100 μg/mL。應(yīng)用WST-1增殖檢測試劑盒進(jìn)行檢測細(xì)胞增殖率，比較單藥組和聯(lián)合組對細(xì)胞抑制程度。細(xì)胞增殖率=（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測 1×10612 h后分成PBS、順鉑2.5 μg/mL、順鉑2.5 μg/mL+妥珠單抗100 μg/mL，紫杉醇0.05 μg/mL，紫杉醇0.05 μg/mL+尼妥珠單抗100 μg/mL及紫杉醇5 μg/mL 6組，24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于PBS中，加入70%乙醇固定，4 ℃孵育過夜。離心去除固定液，將細(xì)胞重懸于含有RNase A（250 mg/mL）的PBS中，加入碘化吡啶（50 mg/mL）37 ℃孵育30 min。應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）檢測細(xì)胞DNA含量分布。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 凋亡檢測的細(xì)胞處理同細(xì)胞周期檢測，收集的PC9細(xì)胞按照TUNEL凋亡檢測試劑盒（Roche,Bioscience,Inc,美國）說明進(jìn)行處理，通過流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson,San Jose,CA）檢測細(xì)胞凋亡。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 免疫熒光染色 將PC9細(xì)胞培養(yǎng)在鋪有蓋玻片的24孔板內(nèi)，12 h后分別加入PBS、尼妥珠單抗、紫杉醇3組，加藥24 h后應(yīng)用4%多聚甲醛固定5 min，給予pH6.0、0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，應(yīng)用1%BSA進(jìn)行封閉，分別加入一抗：兔單抗-微管蛋白（Tublin，Abcam，ab179513，稀釋比1:100）后加入抗兔的異硫氰酸熒光黃標(biāo)記的羊抗兔IgG，洗滌后，加入羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（Phalloidin，稀釋比1:200）；應(yīng)用DAPI染細(xì)胞核。通過Leica SP5激光掃描共聚焦顯微鏡觀察各組熒光染色情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，采用Probit分析計算藥物的IC50值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同化療藥物單用對PC9細(xì)胞增殖的影響 順鉑、紫杉醇、吉西他濱、培美曲塞和長春瑞濱在所檢測的濃度和時間范圍內(nèi)對PC9細(xì)胞增殖的影響差別顯著（圖1）。Probit分析法計算各種藥物在PC9細(xì)胞中的IC50值，藥物的IC50依次為：順鉑0.900 μg/mL、紫杉醇0.136 μg/mL、吉西他濱54.387 μg/mL、培美曲塞56.253 μg/mL和長春瑞濱2.036 μg/mL。

2.2 不同化療藥物聯(lián)合尼妥珠單抗對細(xì)胞增殖的影響 本研究根據(jù)文獻(xiàn)[14,16]回顧，尼妥珠單抗的濃度設(shè)定為100 μg/mL，為了更好地體現(xiàn)聯(lián)合組藥物對細(xì)胞增殖的影響，本研究中化療藥物濃度選擇均低于對應(yīng)的IC50。紫杉醇、順鉑、吉西他濱、培美曲塞和長春瑞濱的濃度依次為0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、2.5 μg/mL、2.5 μg/mL、1 μg/mL。結(jié)果顯示，聯(lián)合組對PC9細(xì)胞增殖抑制強(qiáng)于單藥組，其中尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇對PC9細(xì)胞增殖抑制最為顯著（P＜0.05）（圖2）。

2.3 PC9細(xì)胞周期分布情況 本研究根據(jù)細(xì)胞增殖抑制結(jié)果和紫杉醇作用于G2/M期特點，特選擇紫杉醇和順鉑（非周期特異性藥物）為代表，分析了化療單藥組和化療聯(lián)合尼妥珠單抗組對PC9細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇（0.05 μg/mL）組PC9細(xì)胞G2/M期阻滯細(xì)胞比例67.8%±2.3%顯著高于單藥紫杉醇組26.3%±3.1%（P＜0.05）。尼妥珠單抗聯(lián)合低劑量（0.05 μg/mL）紫杉醇導(dǎo)致的G2/M期細(xì)胞阻滯比例也顯著高于紫杉醇大劑量（5 μg/mL）單藥組；尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑對PC9細(xì)胞的周期分布無明顯影響（P＞0.05）（圖3）。

2.4 PC9細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)上述細(xì)胞增殖和周期分析結(jié)果，本研究選擇了順鉑和紫杉醇做為代表性藥物，觀察化療藥物單獨或聯(lián)合使用尼妥珠單抗對細(xì)胞的凋亡影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化療藥物無論聯(lián)合或不聯(lián)合尼妥珠單抗組中，PC9細(xì)胞凋亡率均顯著高于對照組（P＜0.05）；尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇（0.05 μg/mL）組所致的PC9細(xì)胞凋亡率9.63%±2.04%顯著高于紫杉醇單藥組（0.05 μg/mL）中的4.25%±0.90%（P=0.013），且高于紫杉醇大劑量（5 μg/mL）單藥組5.44%±1.00%；尼妥珠單抗聯(lián)合順鉑組PC9細(xì)胞凋亡率1.43%±0.33%與順鉑單藥組1.00%±0.23%無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.134）（圖4）。

2.5 尼妥珠單抗與化療對PC9細(xì)胞的微管、微絲影響 上述結(jié)果顯示，尼妥珠單抗在與紫杉醇聯(lián)合時使PC9細(xì)胞顯著發(fā)生G2/M期阻滯，并提高了紫杉醇對腫瘤細(xì)胞的殺傷。而長春瑞濱藥理學(xué)作用表明，其也主要是通過作用于腫瘤的G2/M期細(xì)胞發(fā)揮作用。紫杉醇和長春瑞濱二者均作用于G2/M期，但前者抑制微管解聚，后者促進(jìn)微管解聚。因此，本研究應(yīng)用免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡下觀察尼妥珠單抗對PC9細(xì)胞中微管和微絲分布的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼妥珠單抗能夠使PC9細(xì)胞中的微管和微絲聚集且排列更整齊，與紫杉醇促進(jìn)微管整齊聚集排列相一致（圖5）。

3 討論

圖1 不同化療藥物對PC9細(xì)胞增殖影響（24 h）Fig1 Effects of different chemotherapeutic drugs on PC9 cell proliferation after treatment (24 h)

圖2 化療藥物±尼妥珠單抗（100 μg/mL）對PC9細(xì)胞增殖的影響Fig2 Effects of chemotherapeutic drugs with or without nimotuzumab (100 μg/mL) on PC9 cell proliferation

圖3 PC9細(xì)胞周期分布情況。A：空白對照；B：順鉑（2.5 μg/mL）；C：順鉑（2.5 μg/mL）+尼妥珠單抗（100 μg/mL）；D：紫杉醇（0.05 μg/mL）；E：紫杉醇（5 μg/mL）；F：紫杉醇（0.05 μg/mL）+尼妥珠單抗（100 μg/mL）Fig3 Cell cycle distribution of PC cells in different groups.A: control; B: cisplatin (2.5 μg/mL); C: cisplatin (2.5 μg/mL)+nimotuzumab (100 μg/mL); D: paclitaxel (0.05 μg/mL); E: paclitaxel (5 μg/mL); F: paclitaxel (0.05 μg/mL)+nimotuzumab (100 μg/mL).

圖4 順鉑和紫杉醇±尼妥珠單抗對PC9細(xì)胞凋亡的影響Fig4 Effects of chemotherapeutic drugs (cisplatin,paclitaxel) with or without nimotuzumab (100 μg/mL) on PC9 cell apoptosis

EGFR信號通路激活在多種腫瘤的形成、生長和維持中發(fā)揮著重要作用，在NSCLC中也是如此[3,17]。因此，EGFR信號阻斷成為NSCLC潛在的治療靶點。目前阻斷EGFR通路的藥物包括2大類，一種是針對EGFR基因突變的小分子酪氨酸激酶抑制劑，常用藥物包括吉非替尼、厄洛替尼和?？颂婺醄3-8]；另一種是針對EGFR的單克隆抗體，主要包括西妥昔單抗、帕尼單抗和尼妥珠單抗[15,17,18]。FLEX研究證實西妥昔單抗聯(lián)合長春瑞濱及順鉑可以提高晚期NSCLC的客觀緩解率以及延長患者生存[17]，西妥昔單抗可提高多西紫杉醇方案的療效[18]。但隨后研究中，西妥昔單抗并沒有提高培美曲塞聯(lián)合鉑類藥物在NSCLC中的療效[19]。上述研究提示針對EGFR的單抗類藥物對化療療效的影響或許與化療藥物的種類有關(guān)。

尼妥珠單抗是一針對EGFR的人源化IgG1型單克隆抗體，阻斷EGF、TGF-α及其他配體與EGFR結(jié)合，同EGFR結(jié)合的親和力中等，僅為西妥昔單抗的1/10[20]，或許這是尼妥珠單抗毒性遠(yuǎn)低于西妥昔單抗的原因。目前尼妥珠單抗在腦膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、頭頸部腫瘤、胰腺癌、食管癌等多種腫瘤的治療中發(fā)揮了重要作用，可提高化療、放療療效，并延長患者生存期[12,15,21-25]。近期在NSCLC臨床研究中，尼妥珠單抗能夠提高化療藥物的客觀緩解率[26]，并對EGFR基因突變的患者也有效。

本研究選擇的PC9細(xì)胞株是含有EGFR基因突變的NSCLC細(xì)胞株，順鉑、吉西他濱、培美曲塞、紫杉醇、長春瑞濱是NSCLC中常用的五種化療藥物。尼妥珠單抗采用的劑量100 μg/mL為其他研究所推薦劑量[14]。研究發(fā)現(xiàn)尼妥珠單抗對紫杉醇的增敏作用最明顯。因?qū)ζ渌幬镌雒粜Ч幻黠@，為降低資源消耗，研究選擇了周期非特異性藥物順鉑和紫杉醇進(jìn)行了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布的比較。尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇提高了PC9細(xì)胞的凋亡率，使PC9細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯的細(xì)胞比例增加，而對周期非特異性藥物順鉑無影響。提示尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉醇時細(xì)胞增殖抑制明顯的原因或許是尼妥珠單抗促進(jìn)了紫杉類藥物所作用的G2/M期細(xì)胞比例升高有關(guān)。這與Lin等[13]報道類似，即尼妥珠單抗通過提高A549細(xì)胞G2/M期阻滯提高放療的敏感性。但Song等[14]研究發(fā)現(xiàn)尼妥珠單抗在逆轉(zhuǎn)多西紫杉醇耐藥的SPC-A1/DTX細(xì)胞株時，主要是通過G1期阻滯細(xì)胞比例增加而提高SPC-A1/DTX細(xì)胞株對多西紫杉醇的敏感性。Jiang等[16]在研究A549細(xì)胞時，也發(fā)現(xiàn)尼妥珠單抗主要是通過使A549細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，S期細(xì)胞減少，進(jìn)而促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。這些差別的產(chǎn)生或許與研究所用細(xì)胞株不同以及細(xì)胞前期處理不同有關(guān)。

圖5 PC9細(xì)胞中微管、微絲分布情況（間接免疫熒光染色，×630）Fig 5 Tublin and microfilaments dis trib ution of PC9 ce lls in different drug groups (indirect immunofluoresence staining, ×630)

對同屬于G2/M期周期特異性藥物長春瑞濱而言，尼妥珠單抗沒有明顯提高長春瑞濱對PC9細(xì)胞的增殖抑制。藥理學(xué)研究表明長春瑞濱主要通過促進(jìn)微管解聚發(fā)揮細(xì)胞毒作用，而紫杉醇是通過抑制微管解聚發(fā)揮細(xì)胞毒作用。本研究通過應(yīng)用標(biāo)記微管蛋白以及應(yīng)用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼妥珠單抗可以促使細(xì)胞微管、微絲聚集更明顯、排列更整齊，這與紫杉醇的作用機(jī)理類似。因此尼妥珠單抗或許是因使PC9細(xì)胞微管、微絲聚集，從而促進(jìn)抑制微管解聚，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，而發(fā)揮對紫杉類藥物的藥敏作用。近期Babu等[26]應(yīng)用多西紫杉醇+卡鉑±尼妥珠單抗一線治療進(jìn)展期NSCLC患者的多中心期研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉類藥物組同紫杉類單純化療組相比，其客觀緩解率分別為：54%vs34.5%（P＜0.05）。提示尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉類藥物或許是進(jìn)展期NSCLC一線治療或者新輔助治療方案的合理選擇。

本研究存在一定局限性，細(xì)胞株選擇范圍小，進(jìn)一步體外研究將擴(kuò)大細(xì)胞株篩選范圍，明確尼妥珠單抗對化療藥物增敏的影響；此外，尼妥珠單抗在體內(nèi)還可以通過抑制EGFR信號，阻斷血管生成、腫瘤浸潤等發(fā)揮作用，因此在體外研究的基礎(chǔ)上，需要進(jìn)行體內(nèi)和臨床研究驗證。

總之，尼妥珠單抗對不同化療藥物在PC9細(xì)胞中的增敏效果存在差別，其通過使微管、微絲聚集且整齊排列，阻滯PC9細(xì)胞于G2/M期，從而明顯提高紫杉醇敏感性。因此，尼妥珠單抗聯(lián)合紫杉類藥物方案或許是一線或二線治療NSCLC理想選擇。