增強免疫組化和原位雜交方法檢測非小細胞肺癌的ALK重排的臨床可行性

孟輝 高獻爭 張嵐 劉芳 李文才

間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）是一種酪氨酸蛋白激酶，最早在間變性淋巴瘤的一個亞型中被發(fā)現(xiàn)，故得此名。2007年發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中，由于染色體易位引起間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）重排，導(dǎo)致棘皮動物微管相關(guān)蛋白4（echinodermmicro tubule associated protein like 4,EML4）-ALK融合基因形成，催化ALK激酶持續(xù)活化，激活下游信號通路，刺激腫瘤細胞的無限制增殖[1]。繼表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變之后，ALK重排是又一個NSCLC的驅(qū)動基因，ALK重排NSCLC已經(jīng)成為了肺癌的一種新的亞型。這類患者約占5%-7%的NSCLC[2]，通常預(yù)后較差[3]。臨床上ALK重排的檢測方法主要有熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,IHC）和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈擴增法（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）[4]。其中FISH和RT-PCR是在基因?qū)用嫔蠙z測ALK重排，IHC是在蛋白表達層面上檢測ALK重排。各種方法的靈敏度、特異性以及對標(biāo)本的需求等各有不同[4,5]。FISH和PCR的靈敏度和特異性較高，適用于ALK診斷，但是這兩種方法的費用較高，檢測時間長。RT-PCR還需要新鮮組織，對標(biāo)本需要量大。常規(guī)IHC費用較低，檢測時間短，但是結(jié)果的判讀有一定的主觀性，可用于ALK陽性NSCLC的篩查，陽性結(jié)果需要FISH或PCR驗證。增強免疫組化法（enhancing ventana-IHC,V-IHC）采用了特異性很強的抗ALK（D5F3）的兔單克隆抗體結(jié)合增強DAB染色液和增強擴增試劑盒的檢測體系，使用BenchMark XT平臺進行自動化染色，洗片，背景干凈，陽性信號強，結(jié)果容易判定。為了在臨床上準(zhǔn)確快速地找到ALK陽性的NSCLC患者，選擇一種特異，靈敏并且價廉的方法非常重要。為此本研究將利用V-IHC檢測本中心172例NSCLC患者的ALK重排，陽性的患者進一步使用FISH進行驗證，比較V-IHC和FISH檢測方法的相關(guān)性，分析V-IHC作為臨床NSCLC患者ALK重排常規(guī)診斷方法的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本采集 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2014年1月-2014年5月172例NSCLC患者組織標(biāo)本，所有標(biāo)本來源于經(jīng)皮肺穿刺術(shù)、纖維支氣管鏡和（或）頸部、鎖骨上淋巴結(jié)活檢和手術(shù)標(biāo)本，且病理診斷為NSCLC。

1.2 樣本處理流程標(biāo)本處理 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定6 h-24 h，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)自動脫水，石蠟包埋。切片厚約4 μm，用于HE染色、V-IHC和FISH檢測。V-IHC檢測使用正電荷載玻片。

1.3 HE染色 采用HE染色觀察組織細胞形態(tài)，細胞核染色呈深藍色，胞漿染色呈深淺不同的粉紅色，顯示各種組織細胞成分的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點。

1.4 V-IHC檢測 參照V-IHC試劑盒說明書進行。采用抗ALK（D5F3）兔單克隆抗體試劑（免疫組織化學(xué)法）染色對福爾馬林固定、石蠟包埋的NSCLC組織切片進行臨床評估，使用增強DAB染色液和增強擴增試劑盒，在VENTANA BenchMark XT平臺進行染色。分別選取組織切片用于抗ALK（D5F3）兔單克隆抗體試劑（免疫組織化學(xué)法），兔單克隆陰性質(zhì)控抗體，ALK陽性NSCLC病例及ALK陰性NSCLC病例作為系統(tǒng)水平質(zhì)控，以確保染色儀器系統(tǒng)和相關(guān)檢測試劑的性能合乎要求。如果這種系統(tǒng)水平質(zhì)控不合格，就應(yīng)重新染色。

1.5 FISH法檢測ALK融合基因 參照原位雜交試劑盒說明書（vysis ALK-FISH-break-apart Kit）進行，略加改進。使用前，先于病例組與對照組的HE染色標(biāo)本中找到有癌灶部位。在找到的癌灶部位利用靶基因DNA探頭對標(biāo)志基因進行檢測。具體步驟：切片預(yù)處理：4 μm-5 μm石蠟切片65 ℃烤片3 min，常規(guī)脫蠟至水，滴加已復(fù)溫的酶預(yù)處理液，室溫孵育5 min-10 min，蒸餾水洗3次，每次2 min，中性甲醛室溫固定10 min。梯度乙醇脫水（75%、85%、100%乙醇各2 min脫水），自然干燥或電吹風(fēng)吹30 s。變性與雜交：每片滴加10 μL ALK探針混合物，立即用專用雜交蓋片覆蓋81 ℃變性6 min-10 min，42 ℃，雜交過夜（超過10 h）；洗滌：浸入0.4×SSC/0.3%NP-40洗滌液1.5 min，后浸入2×SSC/0.1%NP-40洗滌液0.5 min。70%乙醇洗滌5 min，自然干燥。10 μL-15 μL DAPI復(fù)染。

1.6 結(jié)果判讀 根據(jù)V-IHC試劑盒說明書，ALK陽性腫瘤細胞的特點是任何百分比的腫瘤細胞的胞漿內(nèi)有很強的顆粒狀染色。FISH法參照原位雜交試劑盒說明書，ALK重排的腫瘤細胞特征是橘紅色和綠色信號互相分離，間距至少超過2個信號直徑。無ALK重排的腫瘤細胞特征是橘紅色和綠色信號重合為黃色或者相互粘合。FISH陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是計數(shù)50個腫瘤細胞，如果至少有25個（50%）的細胞存在信號分離，直接判定為陽性。如果信號分離的細胞僅為10%-50%，則需要重復(fù)計數(shù)50個腫瘤細胞，累加100個細胞中至少15個細胞存在信號分離（≥15%），則為ALK陽性。

2 結(jié)果

2.1 NSCLCALK重排的V-IHC檢測 采用系統(tǒng)水平質(zhì)控排除非特異性背景染色。這些非特異染色包括：肺泡巨噬細胞中淺色的胞漿點狀著色，神經(jīng)來源的細胞（神經(jīng)細胞和神經(jīng)節(jié)細胞）和腺上皮染色，淋巴細胞浸潤中一些散在的淋巴網(wǎng)狀細胞及NSCLC中正常粘液（包括粘蛋白）內(nèi)以及壞死區(qū)域的染色。ALK陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)是任何百分比的腫瘤細胞內(nèi)很強的顆粒狀胞漿染色，在整個腫瘤中有著一致的強度（圖1）。利用以上標(biāo)準(zhǔn)判定檢測在172例NSCLC患者有12例為ALK重排陽性，陽性率為6.98%。陽性標(biāo)本中男性8例，女性4例。組織學(xué)分型8例為腺癌，4例為鱗狀細胞癌（圖2），其中有1例為鱗狀上皮原位癌。在這些ALK陽性病例中，腫瘤臨床分期66.7%（8/12）為肺癌中晚期（III期-IV期）。ALK融合基因陽性NSCLC患者的臨床病理特征見表1。

圖1 肺腺癌ALK增強免疫組化染色及FISH染色。肺腺癌組織增強免疫組化染色顯示ALK蛋白表達陽性（A：陽性，×100），ALK陽性腫瘤病例中存在很強的顆粒狀胞漿染色，信號均勻分布，在整個腫瘤部分中有著一致的強度；兔單克隆陰性質(zhì)控抗體對照圖片（B：×100），A、B圖顯示為同一個腫瘤組織標(biāo)本；FISH檢測（C：陽性，×1,000）。Fig1 ALK fusion gene in lung adenocarcinoma (V-IHC and FISH). ALK fusion protein positive in lung adenocarcinoma (A: positive,×100),strong granular cytoplasmic staining exists strong tumor cases,with the uniform signal distribution and the same intensity in the whole tumor section;Rabbit monoclonal antibody negative quality control section (B: ×100). A,B display tissue specimens for the same tumor; FISH detection (C:positive,×1,000).

表1 172例非小細胞肺癌患者的臨床和病理特征Tab1 Clinical and pathological characteristics of 172 cases of non-small cell lung cancer

2.2 FISH驗證 對V-IHC檢測到的12例ALK陽性的患者標(biāo)本行FISH驗證，陽性判定的標(biāo)準(zhǔn)是計數(shù)100個腫瘤細胞，至少有15個細胞呈現(xiàn)紅綠信號的分離，且距離超過2個信號直徑（圖1C）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定11例患者為FISH陽性，1例為FISH陰性，符合率為91.7%（11/12）。這例FISH陰性的患者（鱗狀細胞癌）V-IHC染色呈現(xiàn)出染色不均的特點（圖2A）。

3 討論

圖2 肺鱗癌ALK融合基因增強免疫組化染色（×100）。A：肺鱗癌增強免疫組化染色ALK陽性癌灶部位（箭頭所示）；B：圖片A的單克隆陰性對照圖片（箭頭所示為同一癌灶部位）；C：肺鱗癌增強免疫組化染色強的顆粒狀著色，陽性效果顯著；D：圖片C的單克隆陰性對照圖片。Fig2 ALK fusion gene in lung squamous cell carcinoma using V-IHC staining way (×100). A display ALK positive of V-IHC staining in pulmonary squamous cell carcinoma (arrow); B shows a monoclonal negative control section of A (arrow shows the same position of the squamous cell carcinoma tissue); C: Strong V-IHC positive granular staining of ALK in lung squamous cell carcinoma; D: Rabbit monoclonal antibody negative quality control section of C.

在ALK重排被發(fā)現(xiàn)為NSCLC的驅(qū)動因素的4年后，ALK激酶抑制劑-克唑替尼（Crizotinib，中文商品名：賽可瑞）于2011年在美國被批準(zhǔn)治療ALK陽性的局部晚期和轉(zhuǎn)移性NSCLC?？诉蛱婺嵋痪€治療的客觀緩解率（objective response rate,ORR）為74%，中位無疾病進展生存期（median progression free survival,m-PFS）為10.9 mo。二線治療的有效率為50%-60%，m-PFS為7.0 mo[6-8]。隨著靶向藥物克唑替尼2013年在中國上市，面對中國每年肺癌的新發(fā)病例接近35,000例的現(xiàn)狀，臨床上迫切需要尋找經(jīng)濟簡便的方法，準(zhǔn)確快速地找到ALK陽性的NSCLC患者。由羅氏公司開發(fā)的V-IHC診斷試劑盒已經(jīng)在歐洲和中國獲批用于診斷ALK陽性NSCLC。由于其自動化操作，可使檢測流程和判讀得以標(biāo)準(zhǔn)化。該技術(shù)平臺使用了基于非內(nèi)源性半抗原，信號擴增多聚體和辣根過氧化酶（HRP）的染色信號方法技術(shù)，在不影響特異性的前提下，提高了ALK檢測的靈敏度。結(jié)果判讀采用二分類，即僅為陰性和陽性，陽性結(jié)果即可診斷為ALK陽性NSCLC。有研究證實V-IHC與FISH結(jié)果的吻合率為98.8%，判讀的重復(fù)性為99.7%。本中心利用V-IHC方法對172例NSCLC患者行ALK檢測，有12例為ALK陽性。陽性的標(biāo)本再經(jīng)過FISH驗證，11例為FISH陽性，V-IHC和FISH檢測ALK重排的符合率91.7%。而且將12例陽性病例進行EGFR突變檢測，結(jié)果均為野生型，數(shù)據(jù)未提供。

對于V-IHC檢測ALK陰性的標(biāo)本是否需要FISH驗證？有研究[9]比較了217例經(jīng)過V-IHC檢測為ALK陰性的患者行FISH驗證，同樣也是ALK陰性?；谠撗芯繑?shù)據(jù)和出于檢測費用的考慮，本研究對V-IHC檢測ALK陰性的標(biāo)本沒有再行FISH驗證。

與常規(guī)IHC手動洗片不同，V-IHC采用強度較大的機器洗片，以減少背景干擾。為了避免標(biāo)本在洗滌過程中脫落，推薦使用正電荷載玻片，切片厚度為3 μm-5 μm。在V-IHC檢測為ALK陽性的標(biāo)本中有1例存在著染色不均的現(xiàn)象（圖2A、圖2B）。本例FISH檢測時可以計數(shù)到足夠數(shù)量的腫瘤細胞，但是結(jié)果為FISH陰性。推測可能存在熒光原位雜交探針未覆蓋或染色過程中脫片等原因，也可能和腫瘤異質(zhì)性有關(guān)。

為了減少染色不均的現(xiàn)象，固定液必須是10%中性福爾馬林，在操作上確保固定時間不要低于6 h，組織塊與固定液要充分接觸。建議外科醫(yī)生在固定之前對手術(shù)大標(biāo)本切割2刀-3刀，使標(biāo)本充分浸泡于固定液中。腫瘤異質(zhì)性指的是腫瘤不同部位，或者原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的基因表達不一致的現(xiàn)象。為了避免腫瘤異質(zhì)性對檢測結(jié)果的影響，最好對腫瘤多點取樣同步檢測。V-IHC可在亮視野中觀察，對于觀察染色不均及腫瘤異質(zhì)性的標(biāo)本V-IHC較FISH有一定優(yōu)勢，如圖2。

對于V-IHC染色不均的患者，在標(biāo)本足夠的情況下最好采用FISH驗證。但是FISH的判讀必須要計數(shù)100個腫瘤細胞，至少有15%的陽性細胞才能判定為陽性。有時候小活檢標(biāo)本量太少，難以滿足100個細胞的計數(shù)，可能會影響FISH的判讀，導(dǎo)致判斷為FISH陰性。

ALK重排在東亞地區(qū)肺癌患者中的發(fā)生率約為3%-7%[10]。本研究發(fā)現(xiàn)ALK重排在中國患者中為6.89%，接近于東亞人群。ALK陽性的NSCLC以腺癌為主，鱗癌非常少見[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)6.9%的鱗癌患者為ALK陽性，高于文獻的報道。推測可能為鱗癌組織里混有腺癌的成分。進一步重復(fù)檢測，排除了腺鱗癌的可能。由于該研究樣本量比較小，難以反映鱗癌中ALK陽性比例，需要加大樣本量予以驗證。無論怎樣，ALK陽性的鱗癌患者也是克唑替尼的適用人群。

總的來說，V-IHC靈敏度和特異性高于常規(guī)IHC，結(jié)果容易判讀。V-IHC與FISH比較吻合度高，價格便宜，檢測時間短。標(biāo)本用量小，僅需要1-2張石蠟切片。V-IHC是NSCLC的ALK檢測切實可行的方法，適用于ALK陽性NSCLC的診斷。