張卉 楊新杰 秦娜 李曦 楊惠夷 農(nóng)靖穎 呂嘉林 吳羽華 張權(quán) 張新勇 王敬慧 蘇丹 張樹才

目前已有多項(xiàng)大型III期臨床研究[1-3]結(jié)果證實(shí)存在表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者一線應(yīng)用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）具有較好的臨床療效和安全性，而KRAS基因突變也與肺癌治療的耐藥相關(guān)。但研究也發(fā)現(xiàn)TKI藥物治療更多的是給肺腺癌患者帶來(lái)巨大的臨床獲益，而占NSCLC 20%-30%的肺鱗癌卻仍無(wú)效的靶向藥物指導(dǎo)臨床實(shí)踐[4]，究其原因可能是由于缺乏對(duì)其生物學(xué)特征的了解。EGFR基因突變的肺鱗癌患者是否也具有肺腺癌突變者同樣的靶向治療療效，目前還缺乏大樣本的前瞻性研究。本研究通過(guò)檢測(cè)分析肺鱗癌患者腫瘤組織標(biāo)本EGFR和KRAS基因的突變狀況及與臨床特征之間的關(guān)系，以期為臨床指導(dǎo)患者進(jìn)行有針對(duì)性的治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院2006年1月7日-2014年3月21日收治的初治肺癌患者139例，所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)免疫組化證實(shí)為肺鱗癌并有可供檢測(cè)的腫瘤組織標(biāo)本。其中男性127例，女性12例。年齡33歲-82歲；吸煙（吸煙指數(shù)＞20包/年）93例，輕度吸煙（0＜吸煙指數(shù)＜20包/年）19例，不吸煙（吸煙指數(shù)為0）27例；按2002年美國(guó)癌癥研究聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer,AJCC）癌癥分期手冊(cè)（第6版）NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)，I期25例，II期27例，III期38例，IV期49例。

1.2 主要儀器與試劑 DNA提取試劑盒（美國(guó)Promega公司）；引物、探針合成（廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司）；蛋白酶K（德國(guó)Merck公司）；鏈霉親和素-藻紅蛋白、Taq酶和dNTP（美國(guó)Invitrogen公司）；DNA聚合酶（美國(guó)Promega公司）；微球和Luminex 200TM液相芯片閱讀儀（美國(guó)Luminex公司）；PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；Nanodrop 1000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 突變富集液相芯片法 切取5 μm石蠟包埋標(biāo)本10張，用DNA提取試劑盒從樣本中抽提純化DNA（具體參照產(chǎn)品說(shuō)明書），隨后用Nanodrop 1000分光光度計(jì)對(duì)DNA濃度進(jìn)行定量；所有樣品所提的DNA的量足以用于檢測(cè)。取純化后的DNA作為模板進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，多重PCR反應(yīng)條件為，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，特異切除野生型，反應(yīng)條件為37 ℃ 30 min；取酶切產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集突變型，在96 ℃條件下孵育2 min，反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s，52 ℃ 1 min，74 ℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)；第二次PCR產(chǎn)物與交聯(lián)了特異探針的微球雜交，雜交反應(yīng)在96孔板上進(jìn)行，將PCR產(chǎn)物、微球混合液和雜交液加入反應(yīng)管中，95 ℃ 5 min，然后60 ℃雜交15 min，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白，60 ℃反應(yīng)5 min；于Luminex閱讀儀上讀取數(shù)據(jù)。突變分析由益善醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，EGFR與KRAS基因突變狀態(tài)和臨床特征分析采用卡方檢驗(yàn)和Fisher's精確檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 突變檢測(cè)結(jié)果 139例肺鱗癌EGFR基因突變檢測(cè)中，18外顯子G719X突變3例（2.2%）；19外顯子缺失突變9例（6.5%）；20外顯子突變6例（4.3%）；21外顯子突變6例（4.3%）；同時(shí)存在兩種突變1例（0.7%）；野生型114例，（82.0%）。KRAS基因突變檢測(cè)中，外顯子2突變6例（4.3%）；外顯子3突變1例（0.7%）；野生型132例（95.0%）。同時(shí)存在EGFR19外顯子缺失突變合并KARS外顯子突變1例（0.7%）（表1）。

2.2 突變與臨床特征的關(guān)系 女性和不吸煙的患者EGFR基因突變率高于男性和吸煙患者（33.3%vs16.5%, 29.6%vs16.1%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05,P＞0.05）；不同年齡、分期及病理取材標(biāo)本之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與EGFR基因突變不同的是，男性KRAS基因突變率高于女性（5.5%vs0），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；年齡、分期、吸煙史及病理取材方式各亞組分析中均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

2.3EGFR與KRAS基因突變相關(guān)性分析 139例患者中EGFR基因突變陽(yáng)性患者中有1例（4.0%）同時(shí)發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變，而在EGFR基因野生型患者中，有6例（5.3%）發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4EGFR基因突變與靶向治療療效 在15例EGFR基因敏感突變的患者中，有3例患者（均為19外顯子缺失突變）一線口服TKI藥物靶向治療，1例部分緩解，無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間3個(gè)月；2例疾病進(jìn)展，無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間1個(gè)月。

3 討論

NSCLC患者治療前應(yīng)常規(guī)行EGFR基因突變檢測(cè)已成為共識(shí)，但其中仍有爭(zhēng)議存在。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（American Society of Clinical Oncology, ASCO）認(rèn)為所有NSCLC患者在一線接受EGFR-TKI治療前都需要進(jìn)行EGFR基因突變狀態(tài)的檢測(cè)[5]。歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會(huì)（European Society for Medical Oncology, ESMO）建議在不吸煙/輕微吸煙和非鱗癌患者中進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)[6]。美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)、國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)和美國(guó)分子病理學(xué)會(huì)則建議對(duì)含有腺癌成分和不吸煙的患者進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)[7]。但最新美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)站（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）建議對(duì)肺鱗癌尤其是不吸煙、小活檢組織或混合型鱗癌應(yīng)考慮進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)[8]。這些爭(zhēng)議存在的主要原因是目前并沒(méi)有可靠的臨床研究結(jié)果證實(shí)EGFR基因敏感突變的肺鱗癌患者也同肺腺癌患者一樣具有明顯的EGFR-TKI療效優(yōu)勢(shì)。事實(shí)上，已有臨床研究[9]發(fā)現(xiàn)存在EGFR基因敏感突變的肺鱗癌患者，應(yīng)用TKI藥物治療療效并不理想，但目前仍缺乏大樣本的前瞻性臨床研究結(jié)果。

表1 EGFR和KRAS基因突變檢測(cè)結(jié)果Tab1 Results of EGFR and KRAS mutation status

對(duì)于肺鱗癌中EGFR突變狀態(tài)結(jié)果的報(bào)道也不一致。最近的一項(xiàng)meta分析中[10]，334例西歐肺鱗癌患者中EGFR基因突變率為3.3%，474例東亞肺鱗癌患者中EGFR基因突變率為4.6%，均明顯低于東亞肺腺癌中50.2%的EGFR基因突變率[11]。Hata等[12]研究更認(rèn)為，純肺鱗癌中無(wú)EGFR基因突變。但在Lai等[13]研究中報(bào)道282例肺鱗癌中有41例EGFR基因突變，突變率為14.5%。國(guó)內(nèi)王碧波等[14]認(rèn)為EGFR突變確實(shí)發(fā)生在肺鱗癌患者中。衣素琴等[15]在48例肺鱗癌中檢測(cè)到12例EGFR基因突變，突變率為25%。與其研究結(jié)果相似的是，本研究對(duì)139例肺鱗癌進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，突變率為18%（25/139），明顯高于國(guó)外多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的肺鱗癌EGFR基因突變率低于3.6%的研究結(jié)果。分析其中原因除了種族差異外，也可能與本文采用的突變富集液相芯片法敏感性較高有關(guān)。之前有研究[12]認(rèn)為，在純肺鱗癌中無(wú)EGFR基因突變，肺鱗癌中檢測(cè)到EGFR基因突變是因?yàn)槠渲谢煊邢侔┏煞郑诒狙芯恐杏?6例手術(shù)切除的純肺鱗癌（病理免疫組化染色p40、p63、CK5/6陽(yáng)性，TTF-1、CK7、CEA陰性），其中有18例檢測(cè)到EGFR基因突變，突變率達(dá)20.9%，由此可以看出至少在亞裔人群中，EGFR基因突變?cè)诜西[癌患者中也有發(fā)生。在更進(jìn)一步的亞組分析中發(fā)現(xiàn)，雖然女性和不吸煙的肺鱗癌患者EGFR基因突變率高于男性和吸煙患者（33.3%vs16.5%,29.6%vs 16.1%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05,P＞0.05），而年齡、分期、吸煙史及取材方式與EGFR基因突變無(wú)關(guān)（P＞0.05）。從這些結(jié)果可以看出肺鱗癌EGFR基因突變發(fā)生特點(diǎn)與肺腺癌不同，不具備明顯的突變優(yōu)勢(shì)人群。由于本研究為回顧性研究，并沒(méi)有全部觀察到EGFR基因敏感突變患者口服TKI藥物治療的療效。在其中檢測(cè)到EGFR基因19外顯子敏感突變的9例患者中，僅有3例患者一線口服TKI藥物治療，但療效均不理想，即使是療效達(dá)到部分緩解的患者疾病穩(wěn)定的時(shí)間也明顯短于肺腺癌EGFR敏感突變的患者。這似乎提示肺鱗癌中具有敏感突變的EGFR基因也許并不是靶向治療的“驅(qū)動(dòng)基因”，但這還需大樣本的前瞻性臨床研究。值得一提的是，在本研究中也檢測(cè)到18外顯子少見(jiàn)突變3例（2.2%），20外顯子突變6例（4.3%），這些在肺鱗癌中鮮有報(bào)道，卻都高于肺腺癌研究[11]報(bào)道的結(jié)果（1.4%, 2.9%），其中原因尚不十分清楚，但也可能從另一方面提示肺鱗癌中EGFR基因突變確實(shí)與肺腺癌不同。相較之于肺鱗癌中報(bào)道不一的EGFR基因突變發(fā)生率，KRAS基因突變就更為罕見(jiàn)，相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果也較少。日本的一項(xiàng)關(guān)于非腺癌的研究[16]結(jié)果顯示，116例肺鱗癌中，3例KRAS基因突變。國(guó)內(nèi)羅煒等[17]在454例NSCLC患者KRAS基因突變情況分析中發(fā)現(xiàn)，63例肺鱗癌中僅有1例KRAS基因突變，突變率為1.6%。而本研究139例肺鱗癌中，7例KRAS基因突變，突變率為5.0%，高于羅煒等[17]報(bào)道結(jié)果，但與國(guó)內(nèi)衣素琴等[15]報(bào)道結(jié)果相近（4.17%, 2/48）。其中差異可能有地域差異、檢測(cè)方法不同的原因，同時(shí)也需進(jìn)一步大樣本的臨床研究。有研究[18]認(rèn)為，KRAS基因突變?cè)谖鼰熁颊咧懈装l(fā)生。但根據(jù)一項(xiàng)韓國(guó)的報(bào)道[19]，KRAS基因突變與有無(wú)吸煙無(wú)關(guān)。本研究中也發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與吸煙史無(wú)關(guān)（P＞0.05）。同時(shí)在對(duì)性別和年齡的亞組分析中也未發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變存在差異。值得一提的是，與肺腺癌中KRAS基因突變不同，肺鱗癌中KRAS基因突變與EGFR基因突變不存在明顯相關(guān)性，這可能是因?yàn)榉西[癌中不論是EGFR還是KRAS基因突變率均較低的緣故。

表2 EGFR與KRAS基因突變亞組分析Tab2 Subgroup analysis of EGFR and KRAS mutation status

目前尚無(wú)任何指南對(duì)NSCLC患者的EGFR及KRAS基因突變檢測(cè)方法及檢測(cè)標(biāo)本做出明確規(guī)定。與多數(shù)臨床研究不同的是，本研究采用新型的突變富集液相芯片法，靈敏度可達(dá)到0.1%[20]，檢測(cè)標(biāo)本不僅包含手術(shù)切除的巨大腫瘤組織標(biāo)本（86/139, 61.9%），也有支氣管鏡活檢、肺穿刺、胸膜活檢等臨床更常見(jiàn)的微小組織標(biāo)本（53/139, 38.1%）。所有標(biāo)本EGFR和KRAS基因突變均檢測(cè)成功，且檢測(cè)結(jié)果無(wú)差異（P＞0.05），甚至我們?cè)谘獫{游離DNA的基因突變檢測(cè)中也取得了滿意的結(jié)果[21]。

肺癌的靶向治療時(shí)代已經(jīng)來(lái)臨。相比肺腺癌，肺鱗癌的研究較為滯后，目前仍無(wú)有效的靶向藥物指導(dǎo)臨床實(shí)踐。在肺腺癌中獲得成功的治療經(jīng)驗(yàn)似乎并不能為肺鱗癌患者帶來(lái)相同的獲益。因此，如何選擇肺鱗癌患者的靶向治療，還需分子生物研究者和臨床腫瘤醫(yī)師更為深入的探索研究。