鄭子漂　曲延英　王麗麗等

摘要：針對(duì)棉葉貯藏方法不恰當(dāng)導(dǎo)致DNA提取得率及純度較差的問(wèn)題，本研究以新鮮棉葉為對(duì)照，比較了5種貯藏條件下的棉葉DNA提取效果，以期篩選出一種棉葉貯藏的較優(yōu)模式，從而提高DNA的提取得率及純度。結(jié)果表明，-20℃冷凍3 d的棉葉DNA得率最高且純度較好，甚至比新鮮葉片的DNA得率高51.4%； 3 d冷凍貯藏的DNA得率明顯高于3 d冷鮮貯藏的；7 d液氮冷凍貯藏的DNA得率明顯優(yōu)于7 d硅膠干燥貯藏的和冷凍貯藏的；7 d液氮速凍貯藏的DNA純度與7 d硅膠干燥貯藏的相近。綜上所述，短期貯藏可采用-20℃冷凍保存的方法；較長(zhǎng)時(shí)間的保存建議采用液氮速凍的貯藏方式。

關(guān)鍵詞：貯藏條件；棉葉；DNA提??；純度；得率

中圖分類號(hào)：S562+S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）08-0011-03

Abstract This study was conducted based on the problems that inappropriate storage could lead to poor extraction rate and purity of DNA from cotton leaves. With the fresh leaves as control， the DNA extraction effects of cotton leaves were compared after storage in five kinds of conditions to screen out a best storage method. The results showed that the DNA extraction rate of cotton leaves was the highest after -20℃ frozen storage for 3 days with better purity， which increased by 51.4% compared to that of the control. The DNA yield of 3-day frozen storage was obviously higher than that of 3-day 4℃ storage， and the 7-day liquid nitrogen frozen had clear advantages over the silica gel dry storage and 7-day frozen storage. The DNA purity of 7-day liquid nitrogen frozen was close to that of 7-day silica gel dry storage. In conclusion， -20℃ frozen storage could be used for short-term storage， while the liquid nitrogen frozen could be used for longer-time storage.

Key words Storage condition； Cotton leaves； DNA extraction； Purity； Extraction rate

近年來(lái)， 分子生物技術(shù)在棉花育種上的應(yīng)用，使棉花在抗性、產(chǎn)量及品質(zhì)改良等方面均取得了較大進(jìn)展。但棉花組織中富含酚類及多糖類物質(zhì)，棉葉總DNA的提取較為困難，若采集的鮮葉樣品保存不當(dāng)，將嚴(yán)重影響其DNA的提取純度及得率，進(jìn)而影響后續(xù)分子工作的開展[1～3]。因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段找出滿足不同要求的植物葉片貯藏條件，對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的開展具有重要意義。

本研究以棉花新鮮嫩葉為對(duì)照，比較了不同貯藏條件對(duì)棉葉DNA提取得率及純度的影響，以期篩選出最佳的棉葉貯藏方法，為今后開展分子生物學(xué)和生物技術(shù)試驗(yàn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花品種新陸早26號(hào)、新陸早36號(hào)、新陸早42號(hào)、蘇K202、遼棉18號(hào)，種植于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)病圃。

1.2 試劑

A液：1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0），0.5 mol/L EDTA （pH 8.0），4.5 mol/L NaCl，2% SDS，2% PVP；B液：1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）， 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0）， 4.5 mol/L NaCl，10% CTAB； 5 mol/L醋酸鉀溶液，氯仿+異戊醇（V∶V=24∶1），異丙醇，無(wú)水乙醇，2%β-巰基乙醇。

1.3 樣品采集與處理方法

采集花鈴期葉寬為 1～2 cm的新鮮嫩葉，置于冰盒在5 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，迅速將每個(gè)品種的葉片分成6份并標(biāo)號(hào)，每份約1 200 mg，1號(hào)樣品直接用于提取棉葉DNA， 2號(hào)樣品放入普通冰箱（4℃）冷鮮保存3 d，3號(hào)、4號(hào)樣品分別放入普通冰箱（-20℃）冷凍保存3 d和7 d，5號(hào)樣品放入液氮中（-196℃）保存7 d，6號(hào)樣品用硅膠干燥保存7 d。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 棉葉DNA提取

采用改良CTAB法提取，主要參照石慶華等[4]的方法，稍加改動(dòng)。

1號(hào)樣品取 400 mg洗凈，置于研缽中，加入適量液氮，迅速研磨后，小心緩慢移入 2 mL離心管中，加A液（預(yù)熱至65℃）1 000 μL、β-巰基乙醇 40 μL，放入 65℃恒溫水浴鍋水浴1 h；取出，加入1/3體積的醋酸鉀溶液（5 mol/L），冰浴 1 h后取出，4℃下12 000 r/min離心10 min， 取上清750 μL，加1/5體積的B液后放入65℃恒溫水浴鍋中均勻水浴20 min，取出，室溫冷卻；加入600 μL氯仿+異戊醇（V∶V=24∶1）輕輕搖晃混合，平衡后12 000 r/min離心5 min；取上清液600 μL，用氯仿+異戊醇再抽提1次；取上清500 μL，加2/3體積的異丙醇，置于-20℃冰箱過(guò)夜；次日取出，6 000 r/min離心5 min，棄上清，用70%乙醇洗滌3次，自然風(fēng)干后，溶于50 μL ddH2O中備用。endprint

2、3、4、6號(hào)樣品處理和提取方法同1號(hào)樣品；5號(hào)樣品先用組織粉碎機(jī)粉碎后，再用于DNA的提取，提取方法同1號(hào)樣品。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003處理，采用DPS軟件進(jìn)行方差分析。

DNA得率（μg/gFW）=DNA濃度×DNA溶解于ddH2O的體積/棉葉鮮重

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA產(chǎn)物的得率

由圖1可以看出，冷凍3 d的棉葉DNA平均得率最高，為327.21 μg/gFW；其次為新鮮棉葉的DNA得率，平均為216.23 μg/gFW；冷鮮3 d、液氮冷凍7 d、冷凍7 d和硅膠干燥7 d的棉葉DNA得率均低于對(duì)照（新鮮棉葉），平均得率分別為193.56、116.89、35.47和20.66 μg/gFW。

對(duì)不同貯藏條件下不同品種的棉葉DNA提取得率進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果（見表1）顯示新陸早42號(hào)和新陸早36號(hào)冷凍3 d的DNA得率顯著高于對(duì)照，其它三品種則與對(duì)照差異不顯著；與對(duì)照相比，各品種冷鮮3 d的DNA得率有高有低，但均未達(dá)顯著水平；液氮冷凍7 d，各品種的DNA得率均低于對(duì)照，其中新陸早36號(hào)和蘇K202與對(duì)照的差異達(dá)顯著水平；各品種冷凍7 d和硅膠干燥7 d的DNA得率均顯著低于對(duì)照。綜上所述，就提取棉葉總DNA而言，雖不同品種間變化不同，但總體來(lái)說(shuō)以-20℃冷凍保存3 d的提取效果最好，而且短期（3 d）貯藏的效果明顯優(yōu)于較長(zhǎng)期（7 d）；較長(zhǎng)期貯藏中，則以液氮保存的效果較好。

2.2 DNA產(chǎn)物的純度

由圖2可以看出，對(duì)照新鮮棉葉DNA的OD260/OD280平均值為2.03，冷鮮3 d和冷凍3 d的平均值均為1.96，說(shuō)明冷鮮3 d和冷凍3 d兩種方法保存的棉葉DNA提取純度較好；而冷凍7 d、液氮7 d、硅膠干燥7 d的棉葉DNA OD260/OD280平均值在1.67～1.71之間，說(shuō)明用這三種處理棉葉提取的DNA中有些蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)未除盡。

由表2可以看出，各品種的棉葉DNA提取純度均以鮮葉的最高；冷鮮3 d和冷凍3 d間基本無(wú)差異，且除遼棉18號(hào)與對(duì)照差異顯著外，其余品種均與對(duì)照差異不顯著；冷凍7 d、液氮7 d和硅膠干燥7 d后，不同品種的DNA提取純度變化不同，并無(wú)統(tǒng)一的規(guī)律可循。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，-20℃冷凍保存3 d的棉葉DNA得率最高，純度較優(yōu)。李志真等[5]曾利用冷凍方法貯藏光皮樺鮮葉15 d，結(jié)果因葉片完全褐變未能提取到DNA。而本研究發(fā)現(xiàn)，棉花鮮葉冷凍3 d時(shí)只發(fā)生了輕微均勻褐變，DNA提取效果很好，甚至比鮮葉的DNA得率還高出51.4%；但到第7 d時(shí)，所提取的DNA得率就很低，今后的研究應(yīng)在冷凍 1～7 d內(nèi)設(shè)置更細(xì)化的時(shí)間梯度，尋找最適合的冷凍期限[6，7]。

硅膠干燥法是國(guó)內(nèi)外研究人員貯藏植物組織時(shí)最常用的方法，一般認(rèn)為它的效果最為顯著[8～10]。何天明等[11]曾利用該法保存果樹材料，成功分離出杏的S-Rnase基因并進(jìn)行了特異PCR擴(kuò)增。但本試驗(yàn)中，硅膠干燥法保存的棉葉DNA得率和純度都較低，可能與葉片粉碎顆粒過(guò)大有關(guān)，建議今后采用該方法時(shí)應(yīng)加大粉碎力度并增加粉碎次數(shù)。

綜合來(lái)看，可采用-20℃冷凍保存的方法短期貯藏多酚類植物材料，若需較長(zhǎng)時(shí)間的保存，建議采用液氮速凍的貯藏方式。

參 考 文 獻(xiàn)：

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