李琰　詹曉平　楊靜等

摘要：PIN2蛋白作為生長素外排蛋白，在植物根的向地性生長中起重要作用。免疫定位法是一種可以將蛋白在植物細胞中快速準確定位的方法。本研究利用改良的免疫熒光定位法，對PIN2蛋白在水稻根尖細胞中的定位進行了觀察，并與前人的兩種方法進行比較。結果表明，與已有的方案比較，改良免疫熒光定位法可使PIN2蛋白在水稻根尖細胞中的位置快速準確地被觀察到，且簡化了操作步驟，操作方便快速，可廣泛應用于植物其他蛋白的定位研究。

關鍵詞：PIN2蛋白；免疫熒光定位；水稻；根尖細胞

中圖分類號：S511+S188+.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）08-0104-03

Abstract PIN2 as an auxin efflux protein plays important roles in geotropic growth of plant roots. Immunolocalization technique is a method which allows rapid and reliable in situ localization of proteins in plant cells. In this paper， the improved immunolocalization technique was used to localize the PIN2 in root tip cells of rice， and its effect was compared to the two existing methods. The results showed that the location of PIN2 could be more quickly and accurately determined in root tip cells of rice by the improved method； and the improved method simplified the operation procedures and was more convenient， so it could be used for the localization researches of other plant proteins in the future.

Key words PIN2 protein； Immunolocalization； Rice； Cells of root tips

PIN蛋白家族定位于細胞膜，而這種極性定位決定了生長素的極性流向及梯度分布[1～3]，植物通過維持PIN蛋白在內(nèi)吞循環(huán)途徑及液泡降解與儲存途徑間的動態(tài)平衡，控制生長素的極性運輸效率[4，5]。生長素極性運輸在植物胚胎、側生器官的發(fā)生與發(fā)育、向性生長中起了關鍵性的調(diào)控作用，已成為植物發(fā)育生物學領域中的研究熱點之一[6]。PIN2蛋白屬于生長素的外排蛋白，在植物根尖表皮層及真皮層細胞中表達，主要在植物根向地性生長中起作用[7]。植物根系的向地性決定著根系空間生長的趨勢，對植物養(yǎng)分的吸收 （特別是磷的吸收）具有著重要的影響[8]。因此，深入研究植物根系向地性的分子機制及PIN2蛋白在植物根系中的定位對于植物根系遺傳改良具有實踐和理論的指導意義。

蛋白質的功能、相互聯(lián)系或活性的研究需要一種在細胞及亞細胞水平對蛋白定位的可靠分析方法。Brandizzi等[9]采用DNA與熒光蛋白重組技術研究了活體內(nèi)蛋白的亞細胞定位，其缺點為重組的蛋白質分子特性已改變，可能不會精確定位，基于蛋白抗體的免疫定位則克服了這一缺陷。Lauber[10]和Friml等[11]提出了適于小段組織蛋白免疫定位的方案；Sauer等[12]在他們的方法上進行了改進，使其更加省時、簡便、可自動化。目前，免疫定位技術被廣泛應用于擬南芥、煙草、馬鈴薯等植物的研究中，而水稻根尖組織中蛋白的免疫定位尚未見報道。由于水稻細胞壁擁有“角質-雙硅層”結構，降低了細胞的相對透性[13]，對蛋白免疫定位有較大的干擾。本研究在Friml和Michael的方法上進一步對實驗試劑、承載體及操作步驟進行了優(yōu)化，采用改進的免疫熒光方法，以水稻根尖組織作為供試材料，觀察了PIN2蛋白的定位，并與Friml和Sauer的方法進行分析比較，力求尋找一種簡便快速、可用于水稻根尖細胞中蛋白精確定位的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為野生型水稻LTH，由云南農(nóng)業(yè)大學植物病理重點實驗室提供。

1.2 儀器及試劑

儀器：96孔板，載玻片，真空泵，激光共聚焦顯微鏡（Leica confocal microscope SP5）。

試劑：磷酸鹽緩沖液（PBS），pH 8.06；一抗PIN2-驢抗羊IgG；二抗驢抗雞IgG。

1.3 試驗方法

分別對改良的免疫熒光定位法、Friml和Sauer的蛋白定位方法進行分析比較，具體方法如下。

1.3.1 改良免疫熒光定位法 ①取水稻苗期1 cm根尖組織，置于96孔板內(nèi)。②向裝有根尖組織的孔內(nèi)加入適量4%多聚甲醛固定液，于真空狀態(tài)下室溫固定1 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，再用雙蒸水吹洗2次，每次吹洗均為10 min；最后將根尖組織浸泡于雙蒸水，37℃放置12 min。③用崩潰酶于37℃處理1 h，PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min；加適量滲透液（含10% DMSO和2% Nonidet-P40），室溫處理1.5 h，PBS吹洗6次，每次10 min。④加適量2% BSA，于37℃封閉1 h；加入一抗，于4℃放置過夜；用PBS+0.3% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS+0.5% Triton X-100吹洗5次，每次12 min。⑥在載玻片上滴一滴抗熒光猝滅封片液，將處理的根尖組織放入其中，壓片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。endprint

1.3.2 Friml的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖組織。②使用4%多聚甲醛固定液，于真空狀態(tài)下室溫固定1 h；用PBS和ddH2O分別吹洗2次，每次10 min；將根尖組織置于載玻片上，液氮冷凍干燥后浸泡于PBS中10 min。③用崩潰酶于37℃處理40 min，PBS吹洗4次，每次5 min；加適量滲透液（含10% DMSO和1% Nonidet-P40），室溫處理1 h，用PBS吹洗6次，每次5 min。④加適量2% BSA，于37℃封閉2 h；加入一抗，于4℃放置過夜；用PBS吹洗6次，每次5 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS和ddH2O分別吹洗2次，每次5 min。⑥在載玻片上滴一滴抗熒光猝滅封片液，將處理的根尖組織放入其中，壓片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.3 Sauer的方法 ①取水稻苗期1 cm根尖組織置于微量離心管中。②加入固定液（含4%多聚甲醛，1×PBS和0.1% Triton X-100），于真空狀態(tài)下室溫固定1 h；用PBS和ddH2O分別吹洗2次，每次10 min；將根尖組織置于顯微鏡載玻片上，加一滴水，室溫過夜干燥。③用PBS浸泡5 min，2%崩潰酶于37℃處理1 h，再用PBS吹洗6次，每次5 min；加適量滲透液（含10% DMSO和3% IGEPAL CA-630），室溫處理1 h， PBS吹洗6次，每次5 min。④加適量3% BSA，于室溫封閉1 h；加入一抗，于4℃放置過夜；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑤加入二抗，于37℃放置3 h；用PBS吹洗6次，每次10 min。⑥在載玻片上滴一滴抗熒光猝滅封片液，將處理的根尖組織放入其中，壓片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 水稻根尖組織染色結果

在激光共聚焦顯微鏡下觀察，看到Friml和Sauer方法的部分水稻根尖組織染色效果較混亂，不易于觀察目的蛋白的精確定位；而改進的免疫熒光定位法，大部分水稻根尖組織染色效果較清晰，目的蛋白可以較精確定位（圖1）?？梢姡牧济庖邿晒舛ㄎ环▽λ靖饨M織PIN2蛋白的定位效果要好于Friml和Sauer方法。

2.2 免疫熒光標記蛋白結果

觀察實驗中根尖分生區(qū)與伸長區(qū)的細胞染色結果（圖2），看到細胞膜均被染色，且染色效果較清晰；PIN2蛋白主要分布于細胞膜，這與染色結果相符合，但是細胞表面有多余非特異信號。

3 討論

本試驗主要從以下幾點對Friml和Sauer的方法進行了優(yōu)化：①引入了96孔板，使操作均在96孔板中進行；②調(diào)整了處理及吹洗時間；③調(diào)整了試劑濃度；④多次使用Triton X-100對根尖組織進行處理；⑤簡化了實驗步驟。改良之后的方法縮短了整個實驗過程，96孔板的使用可以使多個平行實驗同時進行，吹洗更加徹底，實驗操作方便快捷，處理效果得到優(yōu)化。

本研究對水稻根尖細胞中蛋白定位的三種方法進行了比較，結果表明，改進后的實驗方案使水稻根尖細胞中目的蛋白PIN2的定位清晰可見，并且實驗步驟簡化，操作方便快速，提高了實驗效率。PIN2作為生長素的外排蛋白，其研究對于探究根發(fā)育的分子機制及推進作物生長發(fā)育的優(yōu)化改良有重大意義，同時，為其它參與內(nèi)吞作用的蛋白的定位提供了較好的方法，有助于深入研究內(nèi)吞作用的機制。

由于操作步驟簡化，改良的免疫熒光定位法存在一定的缺陷，如仍存在有多余非特異信號等，分析其原因可能是與相應抗原發(fā)生了交叉反應，因此本方案仍需要進一步的改進研究。

參 考 文 獻：

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