宋遲　宋衛(wèi)濤　胡艷等

摘要： [WTBX][STBX]IGF1 是重要的生長調控因子，在胚后生長發(fā)育過程中的主要來源為肝臟。以高郵鴨、金定鴨2個地方鴨品種為研究對象，對胚胎期和出雛早期鴨肝臟[WTBX][STBX]IGF1 mRNA的表達規(guī)律進行了比較研究。采用熒光定量PCR和原位雜交技術研究了鴨13、17、21、25、27胚齡和出雛后7 d肝臟[WTBX][STBX]IGF1 mRNA的表達情況。結果表明，2個品種鴨肝臟[WTBX][STBX]IGF1 mRNA在13胚齡均已有少量表達，到出雛前鴨肝臟[WTBX][STBX]IGF1 表達量顯著增高，7 d時，[WTBX][STBX]IGF1 mRNA在高郵鴨肝臟的表達量顯著高于金定鴨。原位雜交結果顯示，肝臟循環(huán)系統(tǒng)中[WTBX][STBX]IGF1 mRNA的表達明顯高于周邊肝臟組織。肝臟[WTBX][STBX]IGF1 mRNA的表達可能在鴨早期發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

關鍵詞： 鴨；肝臟；[WTBX][STBX]IGF1 基因；早期發(fā)育；原位雜交

中圖分類號： S834.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0042-03

動物骨骼肌的發(fā)生、生長在胚胎期即受到嚴格的調控，生長激素等可通過胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）發(fā)揮對動物生長的調控作用 [1-3]。 IGF1可以通過與靶器官上的IGFs受體（ insulin-like growth factor receptor， 結合，從而促進蛋白合成，影響肌肉干細胞增殖、成肌細胞分化以及肌管融合等，起到促進動物骨骼肌生長發(fā)育的作用 [4]。研究表明，在肌肉中過表達 IGF1 基因，會引起肌纖維肥大，蛋白合成增加，促進成肌細胞增殖。Mitchell等在雞胚發(fā)育的24期通過逆轉錄病毒轉入 IGF1 基因，使基因過表達，結果發(fā)現雞腿肌明顯增大，肌纖維數增多 [5]。Scanes 等研究發(fā)現，51 d時快長型雛雞血清中 IGF1 水平顯著高于慢長型雞 [6]。除胚胎期外，肝臟是動物體內 IGF1 最主要的來源 [7]。目前，關于鴨胚胎期 IGF1 發(fā)育變化研究較少。葛盛芳等研究發(fā)現，12 d胚齡的高郵鴨鴨胚血清中可檢測到 IGF1 ，生長速度較快的高郵鴨血清中 IGF1 濃度高于生長速度較慢的紹興蛋鴨，但是鴨胚胎期及胚后發(fā)育早期肝臟中 IGF1 mRNA表達情況尚待研究 [8]。高郵鴨、金定鴨是我國地方鴨品種，這2個品種在生長速度上存在明顯表型差異。本研究以高郵鴨、金定鴨為研究對象，采用實時熒光定量分析技術、原位雜交技術，對鴨胚胎期肝臟中 IGF1 mRNA表達進行探討，研究我國不同地方鴨品種 IGF1 基因在生理水平上的差異，旨在為我國地方鴨品種資源合理利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗種蛋收集自相同日糧水平飼喂的同日齡高郵種鴨、金定種鴨群。2個品種的種蛋在相同條件下（溫度為37.5～37.8 ℃，相對濕度為50%～70%）同時孵化，雛鴨出雛后飼喂相同飼料至7 d。種蛋入孵后24 h設定為1胚齡。分別于13、17、21、25、27 d胚齡以及出雛后7 d等6個時間點采集肝臟樣品，迅速放于液氮中速凍，之后轉入-80 ℃超低溫冰箱保存，每品種在每個采樣時間點采集16份樣品。

1.2 主要試劑和儀器

原位雜交試劑盒購自湖北博士德公司，寡核苷酸探針序列為5′-AAGGAAGTACAAGAACGCAAGTAGA-3′。[JP2]TRNzol-A+總RNA提取試劑（DP421）、SuperReal PreMix（SYBR Green，FP204-01）、Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（QuantScript RT Kit，KR103-04）、pGM-T克隆試劑盒（VT302-02）、 質粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit，DP103-02）、DNA產物純化回收試劑盒（TIANquick Midi Purification Kit，DP204-02）等購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL 2000購自TaKaRa公司；9700PCR儀、Leica冰凍切片機、Mx3000p熒光定量PCR儀購自安捷倫公司。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

按TRNzol-A+總RNA提取試劑操作說明書提取肝臟總RNA。RNA 樣品經1.4%瓊脂糖凝膠電泳分析和紫外分光光度計測定濃度，保證提取的RNA 樣品質量合格。取2 μg總RNA，cDNA 第一鏈的合成按照天根生化科技（北京）有限公司的反轉錄試劑盒說明書進行操作，用內參基因β-actin檢測cDNA合成質量以及是否有基因組DNA污染。RT產物于-20 ℃保存，用于PCR檢測。

1.4 引物設計、目的片段標準品的制備

據GenBank中鴨EU031044序列設計 IGF1 定量試驗引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列為：上游引物5′-CTGGTTGATGCTCTTCAGTTCGTAT-3′；下游引物 5′-GCAGACTTAGGTGGCTTTATTGGA-3′，擴增片段為182 bp。退火溫度60 ℃，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠鑒定后回收目的片段，與pGM-T載體連接，轉化，挑選陽性克隆過夜培養(yǎng)，測序。測序正確的克隆進行質粒提取，測定濃度后作標準品備用。

1.5 熒光實時定量PCR

熒光定量PCR采用SYBR Green I法，含 IGF1 基因的標準質粒做10n（n=7～13）梯度稀釋。將梯度稀釋的標準品和待測樣品同時進行定量PCR，每次反應均設陰性對照，每個樣品設置3次重復。根據由標準質粒構建的標準曲線進行計算，獲得待測樣品目的基因拷貝數。

1.6 原位雜交

肝臟組織樣品的冰凍切片按照原位雜交試劑盒（博士德公司）使用說明進行雜交試驗操作，最后進行DAB顯色液顯色并使用蘇木精染液復染，封片，保存并拍照。

1.7 統(tǒng)計分析

運用SPSS軟件分析基因在同一品種不同發(fā)育時期以及不同品種同一發(fā)育時期表達差異，所有數據以平均值±標準誤表示，P< 0.05表示差異顯著；P< 0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

鴨早期發(fā)育過程中肝臟中 IGF1 mRNA的表達如圖1所示， IGF1 基因在肝臟組織不同發(fā)育時段均表達，呈持續(xù)上升態(tài)勢，并且在2個品種中的表達量變化趨勢較為一致，在13、17胚齡時1 μg總RNA中拷貝數為101數量級，在21、25胚齡時拷貝數上升為102數量級，27胚齡時拷貝數上升為103數量級，出雛后表達量進一步上升。高郵鴨中，27胚齡的表達量極顯著高于之前4個時間點，7 d的表達量極顯著高于其他5個時間點；金定鴨中，27胚齡、7 d的表達量均極顯著高于之前4個時間點，與高郵鴨不同的是，金定鴨27胚齡、7 d的 IGF1 mRNA表達量差異不顯著。2個品種間7 d的表達量差異極顯著，7 d高郵鴨肝臟IGF-I的拷貝數近似于金定鴨的2倍。

[FK（W11][TPSC1.TIF]

原位雜交結果顯示，7 d與27胚齡2個時間點，高郵鴨和金定鴨原位雜交信號較強的部位均為血管組織，25、21胚齡2個時間點的原位雜交則沒有明顯的陽性信號（圖2）。

3 結論與討論

本研究探討高郵鴨、金定鴨2個不同品種鴨胚胎期和出雛早期肝臟 IGF1 mRNA的表達規(guī)律，發(fā)現該基因在13胚齡已有少量表達，這種低表達狀態(tài)持續(xù)至25胚齡，直到27胚齡時顯著提高，并且出雛后 IGF1 mRNA的表達進一步提高。所

[FK（W22][TPSC2.TIF]

檢測的2個品種鴨肝臟組織中 IGF1 mRNA在不同發(fā)育時段均表達，呈持續(xù)上升態(tài)勢，說明不同品種鴨生命早期的肝臟組織中 IGF1 mRNA的表達發(fā)育模式基本一致。7 d高郵鴨肝臟 IGF1 的拷貝數極顯著高于金定鴨，這可能是高郵鴨和金定鴨體質量差異較大的原因之一 [9]。Serrano等發(fā)現，在雞中直到18胚齡時才可以檢測到 IGF1 mRNA的微量表達 [10]。本研究熒光定量PCR檢測結果顯示，鴨胚肝臟中 IGF1 mRNA的表達要早于雞胚，13胚齡時鴨胚肝臟已經有 IGF1 mRNA的微量表達，胚胎發(fā)育末期，肝臟中 IGF1 mRNA的表達已經顯著提高，這一結果表明，禽類胚胎期肝臟 IGF1 mRNA的表達存在一定的種間差異。雞胚胎發(fā)育期間 IGF1 主要來源于肝外組織，出雛后 IGF1 主要來源于肝組織，在鴨肝臟中 IGF1 在臨近出雛時開始大量表達，為出雛后成為 IGF1 的主要來源打下基礎 [11]。 IGF1 是動物體重要的生長調控因子，通過自分泌及旁分泌方式發(fā)揮作用 [12]。因此，對 IGF1 在組織器官中的局部表達部位和模式進行研究，有助于解釋 IGF1 在動物體生長發(fā)育中的調控機制。Juengel等在牛、大鼠的血管壁細胞中檢測到 IGF1 基因表達產物 [13]。Patrick等在負鼠卵巢血管壁細胞中發(fā)現 IGF1 表達 [14]。宋衛(wèi)濤等在鴨胚胎腿肌中發(fā)現， IGF1 基因mRNA在血管壁周圍的表達水平高于血管周邊組織 [15]。這些雜交部位主要由纖維細胞或間充質細胞構成，廣泛分布并融入各個組織和器官中，是 IGF1 通過旁分泌對周圍靶細胞發(fā)揮作用的理想表達部位 [16]。小鼠模型結果顯示，敲除肝臟 IGF1 基因的小鼠血液中 IGF1 濃度下降75%，小鼠仍能正常生長 [17]，循環(huán)系統(tǒng)等肝外組織產生的 IGF1 對小鼠生長發(fā)育可能有重要影響。本研究所關注的發(fā)育時間點中， IGF1 在肝臟循環(huán)系統(tǒng)中的表達量要高于周邊的肝組織，這一表達方式對鴨胚及出雛后生長發(fā)育的影響和具體的分子機制還需要進一步研究。

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