非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與擴(kuò)增的比較及其與血清CEA水平的關(guān)系

黃宇筠袁潤(rùn)強(qiáng) 陳應(yīng)智 袁小玲 繆卓峰 莊楚璇

非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與擴(kuò)增的比較及其與血清CEA水平的關(guān)系

黃宇筠★袁潤(rùn)強(qiáng) 陳應(yīng)智 袁小玲 繆卓峰 莊楚璇

目的 比較分析非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變與擴(kuò)增的關(guān)系，并探討其與血清癌胚抗原（CEA）水平有無相關(guān)性。 方法 對(duì)270例確診非小細(xì)胞肺癌的肺組織標(biāo)本（包括手術(shù)切除及經(jīng)纖支鏡活檢取得）用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法技術(shù)檢測(cè)EGFR基因突變狀態(tài)，用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)EGFR基因的擴(kuò)增情況。治療前抽取患者靜脈血，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CEA水平。 結(jié)果 270例NSCLC中EGFR基因突變率為31.11%，EGFR基因擴(kuò)增率為20%，基因突變并擴(kuò)增的占10.74%?；蛲蛔兘M、基因擴(kuò)增組、基因突變并擴(kuò)增組和基因無突變無擴(kuò)增組血清CEA平均水平分別為［3.03（1.68-6.22）］ng/mL、［3.19（1.8-17.17）］ng/mL、［3.39（1.85-20.87）］ng/mL和［2.54（1.5-4.62）］ng/mL。基因突變組與基因擴(kuò)增組、基因突變組與基因無突變無擴(kuò)增組血清CEA比較無顯著性差異（P＞0.05）?；驍U(kuò)增組與基因無突變無擴(kuò)增組、基因突變并擴(kuò)增組與基因無突變無擴(kuò)增組血清CEA比較有顯著性差異（P＜0.05）。EGFR基因突變、基因擴(kuò)增及基因突變并擴(kuò)增與血清CEA水平有明顯相關(guān)性。 結(jié)論 在NSCLC中EGFR基因突變率大于擴(kuò)增率，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。EGFR基因與血清CEA水平有明顯相關(guān)性。血清CEA水平有可能成為指導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌EGFR靶向治療的指標(biāo)。

表皮生長(zhǎng)因子受體；突變；擴(kuò)增；癌胚抗原；非小細(xì)胞肺癌

［KEY WORDS］Epidermal growth factor receptor（EGFR）；Mutation；Amplification；Carcinoembryonic antigen（CEA）；Non-small cell lung cancer（NSCLC）

肺癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤，占癌癥死亡率的第一位［1］。非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的75%～85%。由于缺乏早期臨床癥狀，確診時(shí)患者已處于進(jìn)展期，治療效果差，五年生存率低于20%［2］。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向治療的出現(xiàn)給這些患者帶來了希望，但其使用需EGFR基因檢測(cè)的指導(dǎo)，技術(shù)要求高，能否用其它指標(biāo)替代EGFR基因檢測(cè)，目前少有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過檢測(cè)NSCLC患者肺組織中EGFR基因突變和擴(kuò)增情況及血清CEA水平，探討EGFR基因突變與基因擴(kuò)增的關(guān)系及EGFR基因與血清CEA是否有聯(lián)系，希望為臨床找出指導(dǎo)EGFR靶向治療的簡(jiǎn)單指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月至2013年9月中山市人民醫(yī)院病理科確診為非小細(xì)胞肺癌的肺組織標(biāo)本（包括手術(shù)切除和經(jīng)纖支鏡取得）270例。年齡（59.47±12.22）歲，其中男性 161例（59.63%），女性109例（40.37%）。所有病例未接受過任何治療。病理標(biāo)本由兩名病理醫(yī)師采取雙盲法進(jìn)行閱片，標(biāo)本的組織分型按照2004年世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類［3］。270例患者中腺癌 192例，鱗癌67例，鱗腺癌4例，大細(xì)胞癌6例，多形癌1例。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

對(duì)所有標(biāo)本采用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)EGFR基因突變情況。采用EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司）及美國(guó)AB17500型PCR儀，并嚴(yán)格按試劑盒使用說明操作。

1.2.2 熒光原位雜交法

對(duì)所有標(biāo)本采用熒光原位雜交法檢測(cè)EGFR擴(kuò)增情況。采用EGFR基因擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司）及美國(guó)Thermo Brite原位雜交儀，并嚴(yán)格按試劑盒使用說明操作。結(jié)果判讀：參考Cappuzzo判斷標(biāo)準(zhǔn)［4］由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生隨機(jī)觀察細(xì)胞 （至少觀察100個(gè)細(xì)胞），統(tǒng)計(jì)紅信號(hào)個(gè)數(shù)和綠信號(hào)個(gè)數(shù)。當(dāng)紅綠信號(hào)比值 ＜2，為陰性結(jié)果。當(dāng)紅綠信號(hào)比值 ＞2或紅色信號(hào)成族狀排列，為陽性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

270例NSCLC中EGFR基因突變有84例，突變率31.11%。EGFR基因擴(kuò)增有54例，擴(kuò)增率20%。同時(shí)存在EGFR基因突變及擴(kuò)增的有29例，占10.74%。EGFR基因與臨床病理特征關(guān)系見表1。EGFR基因陽性組與陰性組比較，患者年齡小、女性多見、腫塊較小、腺癌多見，纖支鏡下陽性率低。各組血清CEA水平見表2。各組血清CEA水平比較見表3?；蛲蛔兘M與基因擴(kuò)增組、基因突變組與基因無突變無擴(kuò)增組血清CEA比較無顯著性差異（P＞0.05）?；驍U(kuò)增組與基因無突變無擴(kuò)增組、基因突變并擴(kuò)增組與基因無突變無擴(kuò)增組血清CEA比較有顯著性差異（P＜0.05）。EGFR基因突變組、EGFR基因擴(kuò)增組、EGFR基因突變并擴(kuò)增組均與血清CEA水平有相關(guān)性（χ2分別為4.060、4.314和4.956，P均小于0.05）。

表1 EGFR基因與臨床病理特征關(guān)系Table 1 The relation of EGFR gene and clinicopathological characteristics

表2 各組血清CEA水平（ng/mL）Table 2 The level of serum CEA in each group（ng/mL）

表3 EGFR各組CEA水平的比較Table 3 Comparison of the serum CEA in each EGFR group

3 討論

大量試驗(yàn)及文獻(xiàn)已證明EGFR基因突變?cè)趤喼萑朔N、女性、非吸煙、腺癌患者中發(fā)生率較高。本研究中，EGFR基因陽性組中女性多見、腺癌多見，與之相符。EGFR是由1 186個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子量為170×103的膜蛋白，其與相應(yīng)的配體結(jié)合后發(fā)生二聚體化，引起質(zhì)膜或胞內(nèi)酪氨酸殘基特異蛋白激酶從無活性轉(zhuǎn)為有活性的形式，從而對(duì)作用底物的某些酪氨酸殘基進(jìn)行特異磷酸化［5］。它控制著細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分裂、分化，當(dāng)中任何一環(huán)節(jié)受到干撓或破壞，細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分裂、分化就會(huì)轉(zhuǎn)為失控狀態(tài)。在非小細(xì)胞肺癌中，EGFR呈高表達(dá)狀態(tài)?；蛲蛔兪侵窪NA或基因中單個(gè)堿基對(duì)的改變?；驍U(kuò)增是指某一些特定亞染色體區(qū)段拷貝數(shù)的增加，而不包括整個(gè)基因組、染色體、臂或大片段染色體區(qū)的擴(kuò)增。EGFR基因擴(kuò)增通常意味著這些基因的過度表達(dá)。Hirsch等［6］檢測(cè)了 69例非小細(xì)胞肺癌患者EGFR蛋白及基因復(fù)制情況，統(tǒng)計(jì)分析顯示蛋白表達(dá)與基因復(fù)制密切相關(guān) （P＜0.001），其中有EGFR基因的擴(kuò)增的患者其EGFR蛋白全部呈過度表達(dá)。Dziadziuszko等［7］報(bào)道66例NSCLC病人的EGFR mRNA含量與基因擴(kuò)增密切相關(guān)（P=0.001），進(jìn)一步證實(shí) Hirsch等［6］的報(bào)道。EGFR基因突變與擴(kuò)增同時(shí)存在的現(xiàn)象已被多個(gè)研究證實(shí)。本研究也觀察到此現(xiàn)象（占10.74%）。有研究報(bào)道EGFR基因突變與擴(kuò)增并存從而影響EGFR的表達(dá)，據(jù)此我們?cè)茰y(cè)EGFR基因突變可能通過基因擴(kuò)增從而影響EGFR的表達(dá)，但Dziadziuszko等［7］的研究結(jié)果同時(shí)也顯示mRNA的表達(dá)與突變無關(guān)（P=0.19），且本研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變率大于EGFR基因擴(kuò)增率（基因突變率為31.11%，而基因擴(kuò)增率為10.74%）。究竟EGFR基因突變與擴(kuò)增之間是一種什么樣的關(guān)系，是否存在另外的機(jī)制影響EGFR的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。本研究EGFR基因突變率大于擴(kuò)增率，與劉紅雨等［8］所做的EGFR基因擴(kuò)增率大于突變率相反。造成結(jié)果的不一致的原因可能為：兩個(gè)研究中入選對(duì)象的一般情況不相同，Paez等［9］報(bào)道EGFR基因突變率在不同的NSCLC患者中不同，其中在女性、腺癌和不吸煙患者中突變高。

CEA屬于細(xì)胞表面的糖蛋白家族，存在于細(xì)胞膜上，為免疫球蛋白超家族成員中的細(xì)胞粘附分子，具有同嗜和異嗜粘附功能。其通過破壞細(xì)胞的極性抑制細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［10-11］，在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能起重要作用［12］。在非小細(xì)胞肺癌中大約有35%～60%患者血清CEA水平升高。血清CEA升高被認(rèn)為是不利的因素，尤其是肺腺癌［13］。本研究中，EGFR基因突變與血清水平有明顯的關(guān)聯(lián)性，與Shoji等［14］研究結(jié)果血清CEA水平與EGFR基因突變有關(guān)相符，這可能是由于EGFR突變下游分子激活促進(jìn)抗凋亡發(fā)生，從而提高了作為抗凋亡產(chǎn)物CEA蛋白的表達(dá)水平所致。有文獻(xiàn)報(bào)道［15］EGFR基因突變與EGFR基因擴(kuò)增有明確的相關(guān)性，但本研究EGFR基因突變組與基因無突變無擴(kuò)增組的血清CEA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而基因擴(kuò)增組與基因無突變無擴(kuò)增組血清CEA水平卻有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此可能為EGFR基因和血清CEA水平之間是通過復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)相互作用，而不僅僅由基因突變所致，基因擴(kuò)增可能在該過程中起著重要的作用，但基因突變組與基因擴(kuò)增組血清CEA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，我們推測(cè)CEA水平的升高，可能還有另外的機(jī)制在作用，此有待進(jìn)一步研究。從本研究結(jié)果可看出，基因突變并擴(kuò)增組的CEA水平比有基因突變或擴(kuò)增組高，這提示在促進(jìn)CEA升高的復(fù)雜機(jī)制中基因突變與擴(kuò)增兩者起相互加強(qiáng)的作用。目前已經(jīng)明確EGFR基因突變成為非小細(xì)胞肺癌服用EGFR-TKI藥物的關(guān)鍵療效預(yù)測(cè)指標(biāo)［9，16］，Gupta等［17］提出EGFR基因擴(kuò)增可能也是EGFR-TKI臨床療效的一個(gè)預(yù)測(cè)因子。有研究表明血清CEA水平在女性、腺癌及腦轉(zhuǎn)移患者明顯升高［18］，與EGFR酪氨酸激酶抑制劑 （tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療的優(yōu)勢(shì)人群相似［19］。袁帥飛等［20］研究示血清CEA水平是NSCLC患者EGFR突變狀態(tài)的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。在中國(guó)的肺腺癌患者中，血清CEA水平也可預(yù)測(cè)EGFR基因的突變率［21］。當(dāng)術(shù)前血清CEA表達(dá)水平在一定的范圍內(nèi)，EGFR基因突變率隨著術(shù)前血清CEA濃度的升高而增高［22］。趙玲娣等［23］證實(shí)：非小細(xì)胞肺癌患者中血清CEA水平比血清CEA水平低者有更好的TKI療效。結(jié)合本研究結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：對(duì)不能獲取手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)時(shí)選擇血清CEA陽性的NSCLC患者接受EGFR的靶向治療，可能會(huì)取得同樣的療效。但究竟血清CEA多高才能預(yù)示EGFR突變、血清CEA多高我們才使用TKI治療，目前尚無相關(guān)研究報(bào)道。血清CEA與EGFR兩者之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究詳細(xì)闡明。

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The comparing of EGFR gene mutation and amplification and its relationship with the serum CEA in non-small cell lung cancer

HUANG Yujun★，YUAN Runqiang，CHEN Yingzhi，YUAN Xiaoling，MIAO Zhuofeng，ZHUANG Chuxuan （Respiration Department， Zhongshan General Hospital， Zhongshan Affiliated Hospital， Sun Yat-Sen University，Zhongshan，Guangdong，China，528400）

Objective To explore the correlation between the epidermal growth factor receptor （EGFR） gene mutation and its amplification in patients with non-small cell lung（NSCLC），and discuss whether it is relevant with the serum carcinoembryonic antigen（CEA）.Methods 270 lung tissue samples diagnosed with NSCLC（including surgical resection and biopsy by bronchoscopy）were taken in.EGFR gene mutation，EGFR gene amplification and serum CEA were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction，fluorescent in situ hybridization and chemiluminescence before treatment，respectively.Results The rate of EGFR gene mutation，EGFR gene amplification，and EGFR gene mutation and amplification were 31.11%，20%，and 10.74%in the 270 cases of NSCLC.The average level of serum CEA in gene mutation group，gene amplification group，gene mutation and amplification group，and gene no mutation without amplification group were［3.03（1.68-6.22）］ng/mL，［3.19（1.8-17.17）］ng/mL，［3.39（1.85-20.87）］ng/mL and［2.54（1.5-4.62）］ng/mL，respectively.There were no significant differences in the level of serum CEA （P＞0.05）in gene mutation group and gene amplification group，gene mutation group and gene no mutationwithout amplification group，respectively.There was significant differences in the level of serum CEA（P＜0.05）in gene amplification group and gene no mutation without amplification group，gene mutations and amplification group and gene no mutation without amplification group，respectively.EGFR gene mutation，gene amplification，gene mutation and amplification were significantly correlative with the level of serum CEA.Conclusion The rate of EGFR gene mutation was higher than that of EGFR gene amplification in the NSCLC.The mechanism remains to be elucidated.There is a significant correlation in EGFR gene and the level of serum CEA.The serum CEA maybe become a marker for guiding EGFR targeted therapy in NSCLC.

國(guó)家“863”計(jì)劃（2011AA02A110）

中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院，中山市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東，中山 528400

黃宇筠，E-mail：sxhyj@126.com