建立一種N-ras突變檢測(cè)的“凸背”引物熒光PCR新技術(shù)

金霆 費(fèi)政芳

建立一種N-ras突變檢測(cè)的“凸背”引物熒光PCR新技術(shù)

金霆 費(fèi)政芳★

目的 建立一種簡(jiǎn)便、省時(shí)、有效的N-ras突變檢測(cè)的“凸背”引物熒光PCR新技術(shù)。

方法 對(duì)比 “凸背”引物熒光PCR新技術(shù)和Sanger測(cè)序法：通過(guò)對(duì)混有不同比例的N-ras基因熱突變G13D（GGT＞GAT）質(zhì)粒的樣本進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)來(lái)比較兩者的靈敏度；對(duì)97例急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）患者的外周血的DNA進(jìn)行N-ras的G13D突變檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)兩者的符合率。 結(jié)果 “凸背”引物熒光PCR新技術(shù)能檢測(cè)出混有5%突變質(zhì)粒型的樣本，其靈敏度達(dá)5%，高于Sanger測(cè)序法的10%～20%。在97例AML患者的外周血的DNA中，“凸背”引物熒光PCR新方法和Sanger測(cè)序法檢測(cè)到N-ras基因G13D突變分別為19例和18例，符合率達(dá)94.7%。 結(jié)論 “凸背”引物熒光PCR新技術(shù)比測(cè)序法更為快速、簡(jiǎn)單，有更高的靈敏度，容易實(shí)現(xiàn)。

N-ras；“凸背”引物熒光PCR新技術(shù)；Sanger測(cè)序法

急 性 髓 細(xì) 胞 白 血 病 （acutemyelocytic leukemia，AML）是由多能干細(xì)胞或已輕度分化的前體細(xì)胞核型發(fā)生突變所形成的造血系統(tǒng)的克隆性惡性疾?。?-2］，是一個(gè)具有高度異質(zhì)性的疾病群。被克隆的白血病細(xì)胞，會(huì)產(chǎn)生凋亡遇阻、分化阻礙、增殖失控等問(wèn)題，讓細(xì)胞停滯在不同的發(fā)育階段［3］。AML占成年人急性白血病的70%左右，是惡性腫瘤中死亡率較高的疾病之一。其年發(fā)生率約為4.6/10萬(wàn)人，男性略多于女性。越來(lái)越多研究表明，AML的發(fā)生與基因突變有關(guān)，其中與N-ras的基因突變［4-5］的關(guān)系最大。N-ras是ras基因家族中的一員，其突變導(dǎo)致Ras-GTP處于持續(xù)激活狀態(tài)，引起細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移。當(dāng)Ras蛋白接受信號(hào)刺激或自身突變活化后，主要通過(guò)刺激兩條途徑 （Raf/Mek/Erk增殖和 PI3K/Akt抗凋亡）上的蛋白磷酸化來(lái)發(fā)揮作用，進(jìn)而導(dǎo)致AML的發(fā)生［6］。N-ras基因發(fā)生突變時(shí)不利于預(yù)后［7-8］。研究表明，MDS患者在向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中，常常會(huì)發(fā)生N-ras基因突變［9-10］，可作為AML患者預(yù)后的一個(gè)判斷。其中，N-ras主要基因突變發(fā)生于1號(hào)外顯子的 12、13密碼子上，由G突變?yōu)锳［11-13］。本文采用 “凸背”引物熒光PCR新方法和Sanger測(cè)序法檢測(cè)N-ras的1號(hào)外顯子13密碼子G13D （GGT＞GAT）突變型，比較兩者的一致性和靈敏性，尋找一種準(zhǔn)確、便捷、有效的N-ras基因突變檢測(cè)方法，以便更好地作為醫(yī)生判斷患者情況的參考，有利于患者的治療。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院2012年至2013年間AML患者的外周血97例。其中男性患者61例（62.89%），女性患者36例（37.11%）。年齡范圍為50至80歲，其中男性患者67.3±8.6歲，女性患者69.4±7.6歲。標(biāo)本均為檢驗(yàn)科存檔血液樣品。

1.2 主要儀器與試劑盒

應(yīng)用7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司），ABI 9700 PCR儀 （ABI公司）和QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒（Qiagen公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 方法

1.3.1 外周血DNA提取

采用Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取基因組DNA，提取后放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

用Primer Express 5.0軟件為“凸背”引物熒光PCR新方法設(shè)計(jì)N-ras基因的1號(hào)外顯子的野生型引物探針和突變型引物探針。其中，野生型的上游引物為NRAS-FW1：5′-GTGGTGGTTGGAGCA AAAAG-3′；突變型G13D的上游引物為Nras-FM1： 5′-ACTGGTGGTGGTTGGAGCAAAAAA-3′。共用的下游引物為Nras-RW1：5′-AAGTGGTT CTGGATTAGCTG-3′。共用的探針為Nras-PW1：5′-TGTTGGGAAAAGCGCACTGACAATC-3′。為Sanger測(cè)序法設(shè)計(jì)引物：上游引物為Nras-F2：5′-GCTGTTCATGGCGGTTCC-3′，下游引物為Nras-R2：5′-AGAATCCTCTATGGTGGGATCA-3′，大小為218 bp。

1.3.3 “凸背”引物熒光PCR新方法檢測(cè)

在“凸背”引物熒光PCR新方法中，設(shè)計(jì)的野生型上游引物和突變型上游引物分別檢測(cè)N-ras野生型和 N-ras的 G13D突變型。上游引物在N-ras基因的G13D突變點(diǎn)區(qū)與相應(yīng)型別的模板匹配 （野生型上游引物與N-ras野生型模板匹配，突變型上游引物與N-ras的G13D突變型匹配）。但導(dǎo)入5個(gè)A堿基發(fā)生突變點(diǎn)后，導(dǎo)入堿基與原序列不匹配而構(gòu)造1個(gè)“凸背”。因?yàn)椤巴贡场迸c基因原序列不匹配，所以引物跟模板的結(jié)合力不強(qiáng)。當(dāng)其3′端堿基序列與模板相匹配，引物就可以繼續(xù)延伸，產(chǎn)生熒光曲線。而當(dāng)其3′端堿基序列與模板不匹配時(shí)，因?yàn)橐锏摹巴贡场苯Y(jié)構(gòu)的影響，引物將不能延伸下去，無(wú)法PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不了熒光曲線（見(jiàn)圖1）。

在7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)同一標(biāo)本DNA進(jìn)行野生型引物探針和突變型引物探針的熒光定量PCR。反應(yīng)條件：95℃15 min；93℃15 s，55℃ 50 s，40個(gè)循環(huán)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析：同一個(gè)標(biāo)本，若有突變型引探管有熒光曲線，而野生型引探管沒(méi)有熒光曲線，則此標(biāo)本為G13D突變型；反之，野生型引探管有熒光曲線，突變型引探管沒(méi)有熒光曲線，則此樣本為野生型；若兩者皆有熒光曲線，則此樣本雜合型，即既有野生型DNA，也有突變型DNA（見(jiàn)圖2）。

圖1 “凸背”引物的作用示意圖

1.3.4 Sanger測(cè)序法檢測(cè)

第一步，用引物Nras-F2和Nras-R2在ABI 9700 PCR儀進(jìn)行N-ras的目的基因PCR擴(kuò)增。第二步，待PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否在218 bp處有目的條帶。第三步，看到有明顯的單一目的條帶，則純化回收PCR產(chǎn)物。第四步，在3500 xL Genetic Analyzer上進(jìn)行PCR測(cè)序，然后利用ABI公司Sequencing Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和分析。

1.4 兩種方法靈敏度的檢測(cè)

先將N-ras野生型質(zhì)粒和G13D突變型質(zhì)粒兩者稀釋至同一濃度：2 ng/μL。然后，以不同的比例 （100%、50%、20%、10%、5%、1%、0%）混合兩者，作為PCR模板，分別用“凸背”引物熒光PCR新方法和Sanger測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 兩種方法對(duì)97例AML患者的外周血標(biāo)本的檢測(cè)

同時(shí)用“凸背”引物熒光PCR新方法和Sanger測(cè)序法對(duì)97例AML患者的外周血標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并用配對(duì)四格表統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兩種方法靈敏度的比較

在混有不同比例N-ras突變型G13D基因的樣本中，“凸背”引物熒光PCR新方法能檢測(cè)出含5%G13D型突變的樣本，即靈敏度達(dá)5%（見(jiàn)圖3），而Sanger測(cè)序法的靈敏度為10%～20%，故該方法的靈敏度比傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序法更高。

圖3 “凸背”引物熒光PCR新方法的靈敏度

2.2 兩種方法檢測(cè)97例AML標(biāo)本結(jié)果

“凸背”引物熒光PCR新方法在97例AML 患者外周血標(biāo)本中，共檢測(cè)到N-ras基因G13D突變19例。Sanger測(cè)序法檢測(cè)到18例（見(jiàn)圖4）。

將Sanger測(cè)序法和“凸背”引物熒光PCR新方法檢測(cè)結(jié)果不同的樣本的PCR產(chǎn)物做克隆，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，該樣本含有G13D突變，這說(shuō)明了“凸背”引物熒光PCR新方法的靈敏度高。

對(duì)“凸背”引物熒光PCR新方法和Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，如下表（表1）。用配對(duì)卡方檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，經(jīng)SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，Kappa=0.9（P＜0.001），兩方法檢測(cè)結(jié)果的一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢測(cè)一致性好。

3 討論

AML與環(huán)境、職業(yè)及遺傳因素都有密切的關(guān)系。而且，發(fā)達(dá)國(guó)家患AML的幾率比發(fā)展中國(guó)家高，人類(lèi)會(huì)隨年齡的增加而增加患AML的風(fēng)險(xiǎn)。AML可以說(shuō)是一種中、老年病，占成人急性白血病的70%左右，男性發(fā)病高于女性。

Ras基因的蛋白產(chǎn)物 p21是一種膜結(jié)合 G蛋白，多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都與其有關(guān)，如MEK、EPK［14］。當(dāng)ras基因發(fā)生突變，其功能就處于異常活躍狀態(tài)，失去控制，持續(xù)不停地激活調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞異常生長(zhǎng)。在ras基因中，MDS的患者在向AML轉(zhuǎn)化過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生N-ras基因突變［15-16］。因此，檢測(cè)N-ras基因是否發(fā)生突變，有很大的意義。

圖4 Sanger測(cè)序法的測(cè)序結(jié)果

表1 “凸背”引物熒光PCR技術(shù)法和Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果Table 1 The detective results of“convex dorsal”primers fluorescent PCR method and Sanger sequencing method

雖然直接測(cè)序法是檢測(cè)基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但其缺點(diǎn)也特別明顯：靈敏度不高、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣，容易在中間環(huán)節(jié)出差錯(cuò)。對(duì)于突變比例低的標(biāo)本進(jìn)行基因突變檢測(cè)的時(shí)候，直接測(cè)序法是無(wú)法精確的。

本文同時(shí)用 “凸背”引物熒光PCR新方法和Sanger測(cè)序法對(duì)97例AML患者的N-ras的1號(hào)外顯子的熱點(diǎn)突變G13D進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者達(dá)到94.7%的符合率。用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法檢測(cè)比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，經(jīng)SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，Kappa=0.9（P＜0.001），兩方法檢測(cè)結(jié)果的一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢測(cè)一致性極好。在檢測(cè)N-ras基因G13D突變上，“凸背”引物熒光PCR新方法比Sanger測(cè)序法多檢測(cè)出一例突變標(biāo)本。經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序復(fù)核驗(yàn)證，該例標(biāo)本為G13D突變。

從靈敏度上來(lái)看，“凸背”引物熒光PCR新方法能檢測(cè)出低至混有5%N-ras基因G13D突變型質(zhì)粒的樣本，即靈敏度達(dá)5%，而Sanger測(cè)序法只能達(dá)到10%～20%，說(shuō)明“凸背”引物熒光PCR新方法更有優(yōu)勢(shì)。從操作和速度上來(lái)比較，“凸背”引物熒光PCR新方法能采用96個(gè)孔板的實(shí)時(shí)熒光PCR儀，在2個(gè)小時(shí)內(nèi)能得出90多個(gè)樣本的結(jié)果，而Sanger測(cè)序法的操作和時(shí)間上都不如 “凸背”引物熒光PCR新方法。

綜上所述，在N-ras基因突變檢測(cè)中，較之Sanger測(cè)序法，“凸背”引物熒光PCR新方法具有迅速、簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，能方便應(yīng)用到研究N-ras與AML之間的直接關(guān)系，也為AML預(yù)后提供有力依據(jù)。

［1］ 邱林，馬俊.急性髓細(xì)胞白血病預(yù)后相關(guān)分子遺傳學(xué)研究的最新進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2011，8（4）1-6.

［2］ 彭玲，羅軍.急性髓細(xì)胞白血病FLT3基因突變及靶向治療研究進(jìn)展［J］.Internal Medicine of China，2008，3 （2）：232-234.

［3］Reuter CW，Krauter J，Onono FO，et al.Lack of noncanonical RAS mutations in cytogenetically normal acute myeloid leukemia［J］.Ann Hematol，2014，93（6）：977-982.

［4］Jeong JH，Park SH，Park MJ，et al.N-ras mutation detection by pyrosequencing in adult patients with acute myeloid leukemia at a single institution［J］.Ann Lab Med，2013，33（3）：159-166.

［5］Yang X，Qian J，Sun A，et al.RAS mutation analysis in a large cohort of Chinese patients with acute myeloid leukemia［J］.Clin Biochem，2013，46（7-8）：579-583.

［6］Levis M.Recent advances in the development of smallmolecule inhibitors for the treatment of acute myeloid leukemia［J］.Current Opinion in Hematology，2005，12（1）：55-61.

［7］Kiyoi H， Naoe T， Nakano Y， et al.Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute myeloid leukemia［J］.Blood，1999，93（9）：3074-3080.

［8］de Melo MB，Lorand-Metze I，Lima CS，et al.N-ras gene point mutations in Brazilian acute myelogenous leukemia patients correlate with a poor prognosis［J］.Leuk Lymphoma，1997，24（3-4）：309-317.

［9］Kelly LM，Liu Q，Kutok JL，et al.FLT3 internal tandem duplication mutations associated with human acute myeloid leukemias induce myeloproliferative disease in a murine bone marrow transplant model［J］.Blood，2002，99（1）：310-318.

［10］Shih LY，Huang CF，Wang PN，et al.Acquisition of FLT3 or N-ras mutations is frequently associated with progression ofmyelodysplastic syndrome to acute myeloid leukemia［J］.Leukemia，2004，18（3）：466-475.

［11］Speletas M，Arvanitidi K，Tzoanopoulos D，et al.Rapid mutational analysis of N-ras proto-oncogenein hematologic malignancies：study of 77 Greek patients［J］.Haematologica，2001，86（9）：918-927.

［12］Auewarakul CU，Lauhakirti D，Tocharoentanaphol C.Frequency of RAS gene mutation and its cooperative genetic events in Southeast Asian adult acute myeloid leukemia［J］.Eur J Haematol，2006，77（1）：51-56.

［13］Molina JR，Adjei AA.The Ras/Raf/MAPK Pathway［J］.Journal of Thoracic Oncology，2006，1（1）：7-9.

［14］Milella M，Tafuri A，Gregorj C，et al.Beyond single pathway inhibition：MEK inhibitors as a platform for the development of pharmacological combinations with synergistic anti-leukemic effects［J］.Current Pharmaceutical Design，2005，11（21）：2779-2795.

［15］de Souza FT，de Menezes SJ，Macedo SML，et al.Correlation ofN-raspointmutationswith specific chromosomal abnormalities in primary myelodysplastic syndrome［J］.Leukemia Research，1998，22（2）：125-134.

［16］Padua RA，Guinn BA，Al-Sabah AI，et al.RAS，F(xiàn)MS and p53 mutations and poor clinical outcome in myelodysplasias：a 10-year follow-up［J］.Leukemia，1998，12（6）：887-892.

Establishment of a new “convex dorsal” primer fluorescence PCR method to detect the mutation of N-ras

JIN Ting，F(xiàn)EI Zhengfang★
（Clinical Laboratory，The First Hospital of Fuzhou，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian，China，350004）

Objective To establish a simple， rapid and effective“convex dorsal” primer fluorescence PCR to detect the mutation of N-ras.Methods The N-ras mutation of G13D （GGT＞GAT）was detected by “convex dorsal” primers fluorescent PCR method and Sanger sequencing method，respectively.The samples which were mixed with different proportions of the N-ras mutant plasmid（two methods）were detected，and their coincidence rates were calculated.97 acute myeloid leukemia（AML）peripheral blood samples were tested，and their coincidence rate was calculated.Results The samples which were mixed with 5%N-ras mutant plasmid can be detected by the “convex dorsal” primers fluorescent PCR method.Its sensitivity（5%）was higher than Sanger sequencing method’s.In 97 acutemyeloid leukemia（AML）peripheral blood samples，19 case with N-ras mutations（G13D）were detected by“convex dorsal”primers fluorescent PCR method，and 18 case with N-ras mutations（G13D）were detected by Sanger sequencing method.The coincidence rate is 94.7%.Conclusion The “convex dorsal”primers fluorescent PCR method is more convenient，high sensitivity than sequencing method，and easily achieved.［KEY WORDS］N-ras；“Convex dorsal”primers fluorescent PCR method；Sanger sequencingmethod

·綜 述·

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建，福州 350004★

費(fèi)政芳，E-mail：fzf776@163.com