賈慧等

摘要： 為研究玉米大斑病菌黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]的功能，采用PCR方法克隆得到[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因3 021 bp的OFR序列，將其插入到含有色氨酸強啟動子、GFP和bar基因抗性的質(zhì)粒pBARKS1-eGFP上構建回復載體pBARKS1-MR-eGFP，通過測序、雙酶切驗證載體構建情況。結果顯示，pBARKS1-MR-eGFP載體構建成功，可以進行基因回復轉化試驗。該結果為進一步確定黑色素合成調(diào)控途徑，進而明確黑色素合成調(diào)控機制奠定基礎。

關鍵詞： 玉米大斑病菌；黑色素；調(diào)控基因；[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]

中圖分類號： S435.131.4+9 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0024-03

玉米大斑病在世界范圍內(nèi)廣泛存在，是我國冷涼地區(qū)如東北、華北和西南玉米區(qū)重要葉部病害 [1-2]，種植感病品種如遇到流行年份可減產(chǎn)50%以上。例如，2012年受布拉萬臺風的影響，東北地區(qū)潮濕多雨，玉米大斑病大暴發(fā)，平均危害程度3～5級，嚴重地塊達9級。引起該病害的病原菌屬半知菌突臍蠕孢屬，1876年在意大利首次報道，其無性態(tài)為玉米大斑凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum），有性態(tài)為玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）。有研究發(fā)現(xiàn)，玉米大斑病菌代謝產(chǎn)生的DHN黑色素是該病菌致病的重要毒力因子，沉積在真菌特化結構、附著在胞細胞壁和細胞膜之間，產(chǎn)生機械壓力突破寄主表皮細胞，使植物染病 [3]。

DHN黑色素合成途徑至少有聚酮體合成酶、還原酶、脫水酶、氧化酶4類蛋白酶參與。起始于1個聚酮體合成酶（polyketide synthase），催化醋酸鹽合成1，3，6，8-4THN，經(jīng)還原酶（1，3，6，8-tetra-HN reductase）催化合成小柱孢酮（scytalone），脫水酶（scytalone dehydratase）催化合成1，3，8-THN，還原酶（1，3，8-tetra-HN reductase）催化合成柱孢醌（vermelone），再經(jīng)脫水酶催化合成1，8-DHN，最后經(jīng)氧化酶（laccase）氧化聚合形成1，8-DHN黑色素。另外，該途徑中還存在一種調(diào)控黑色素生物合成的轉錄因子MR [4]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控黑色素合成的轉錄因子能夠調(diào)節(jié)黑色素合成途徑中的多個關鍵酶基因的表達，進而影響黑色素的生成，改變病原菌致病力。水稻胡麻斑病菌（Bipolaris oryzae）中黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]BMR1突變后，菌落顏色變白，過表達菌株的BMR1[WTBZ][STBZ]表達量高于野生型的10倍 [5]。葫蘆刺盤孢（Colletotrichum lagenarium）和稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）中Cmr1p和Pig1p是黑色素合成轉錄因子，編碼基因[WTBX][STBX]Cmr1和Pig1[WTBZ][STBZ]突變后病原菌的黑色素合成受到影響，回復突變后，病原菌生長表型與野生型相似，說明功能回復到正常水平 [4]。甘藍鏈格孢（Alternaria brassicicola）黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]Amr1[WTBZ][STBZ]突變后，病原菌菌落顏色變淺，接種白菜葉片發(fā)現(xiàn)致病力較野生型增強 [6]。同時，文獻報道，絲狀真菌中黑色素合成酶基因缺失或沉默，黑色素合成則會受到影響，病原菌的致病力也有不同程度的變化 [7]。玉米大斑病菌中聚酮體合成酶基因（StPKS）RNAi的幾株轉化子黑色素合成受到不同程度的干擾 [8]；玉米大斑病菌中HN還原酶基因（[WTBX][STBX]3HNR[WTBZ][STBZ]）突變則形成淺褐色突變菌株 [9]；玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）脫水酶基因（[WTBX][STBX]scl1[WTBZ][STBZ]）缺失后形成橙紅色菌落 [10]；條件致病真菌新型隱球酵母菌（Cryptococcus neoformans）氧化酶基因[WTBX][STBX]LAC1缺失后，菌落顏色發(fā)生了變化，而同工酶基因LAC2的轉錄水平遠遠低于LAC1[WTBZ][STBZ]基因，該基因缺失后，病原菌黑色素合成速度延遲，合成量并未受到影響 [11]。目前，以抑制黑色素合成過程中從1，3，6，8-四羥基萘到小柱孢酮、1，3，8-三羥基萘到柱孢醌的2步脫氫反應的2個還原酶為靶點開發(fā)的特異性抑制劑——三環(huán)唑（tricyclazole）作為新型殺菌劑防治稻瘟病菌，有良好效果 [12]。本研究室前期克隆到黑色素合成調(diào)控基因[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]，利用基因敲除技術獲得了該基因的2株基因缺失突變體，初步分析了突變體的生長發(fā)育、黑色素合成及致病性等與野生型的差別，初步明確了該基因的功能，發(fā)現(xiàn)[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因缺失后，病原菌生長速度沒有明顯變化，黑色素含量顯著降低，致病力明顯減弱。本試驗在前期研究的基礎上構建[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因回復載體，從而對[WTBX][STBX]StMR1[WTBZ][STBZ]基因功能及黑色合成調(diào)控機制進行深入研究，以闡明玉米大斑病菌的致病機制，也可以為研發(fā)新型殺菌劑、探索新的防治途徑提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米大斑病菌菌株01-23、pBARKS1-eGFP載體、大腸桿菌（Eschrichia coli）DH5α感受態(tài)細胞、SDS堿裂解溶液（溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），由河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室保存或配制；UNIQ-10柱式Trizol RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DEPC、DNaseⅠ（RNase free）、RNasin、dNTP Mixture、限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶，購自寶生物（大連）有限公司；引物的合成和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2 總RNA的提取

參照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書，取經(jīng)PD液體培養(yǎng)基21 ℃、黑暗培養(yǎng)7 d的玉米大斑病菌菌絲，濾紙吸干，取0.1 g用液氮研磨成粉末，轉移至1.5 mL離心管中，加入Trizol試劑 1 mL，并用槍頭反復吹打，室溫放置5～10 min，使核蛋白與核酸完全分離；加入200 μL三氯甲烷 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1）劇烈振蕩30 s，室溫放置3 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min；吸取上層水相轉移至干凈離心管中，加入 1/2 體積無水乙醇，混勻；將吸附柱放入收集管中，用移液器將溶液和半透明纖維狀懸浮物全部加至吸附柱中，靜置 2 min，12 000 r/min 離心3 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放入收集管中，加入500 μL RPE Solution，靜置 2 min，10 000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液（檢查RPE Solution是否已經(jīng)按比例加入無水乙醇），此步驟重復1次；將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min離心2 min，將殘余的乙醇去除；將吸附柱加入干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中央加入30 μL DEPC-treated ddH2O，靜置5 min，12 000 r/min離心2 min，提取得到RNA樣品溶液，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｅ渲?0%瓊脂糖凝膠，電泳檢測得到的總RNA的純度及完整性；紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

1.3 反轉錄合成第一鏈cDNA

反轉錄反應：1 μg模板RNA，1 μL Oligo （dT）12～18 Primer（50 μmol/L），RNase free ddH2O補充至6 μL，70 ℃保溫 10 min 后迅速在冰上急冷2 min以上，離心數(shù)秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集于微管底部；在該微管中加入5×M-MLV buffer 2 μL，dNTP Mixture（10 mmol/L） 0.5 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）0.25 μL，RTase M-MLV（RNase H-，200 U/μL）0.25～1 μL，RNase free ddH2O補充至 10 μL；42 ℃保溫1 h，70 ℃滅活反轉錄酶活性15 min，插冰上冷卻；反應合成第一鏈cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因ORF序列的獲得

分析 基因序列的酶切位點，根據(jù)載體pBARKS1-eGFP上的多克隆位點，設計帶有酶切位點NotⅠ和SmaⅠ的特異引物MGF、MGR，擴增 基因的ORF序列。

擴增體系：2 μL模板cDNA，MGF（10 μmol/L）1.0 μL，MGR（10 μmol/L）1.0 μL，2.5 μL 10×Taq buffer（Mg 2+Plus），2 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），0.3 μL Taq DNA聚合酶（5 U），ddH2O 16.2 μL。

擴增程序：95 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性 30 s，61 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸4 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，紫外凝膠成像儀（Bio-Rad）觀察結果顯示，DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR擴增產(chǎn)物。

1.5 基因回復載體的構建

將回收PCR擴增產(chǎn)物和pBARKS1-eGFP載體用 SmaⅠ、NotⅠ雙酶切，酶切體系為pBARKS1-eGFP質(zhì)粒DNA 2 μL（PCR回收產(chǎn)物5 μL），SmaⅠ、NotⅠ各1 μL，緩沖液 2 μL，ddH2O補充至10 μL，37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收線性[JP2]質(zhì)粒片段和PCR產(chǎn)物。然后進行連接反應，反應體系為PCR擴增產(chǎn)物5 μL、pBARKS1- eGFP線性質(zhì)粒 1 μL、T4連接酶（350 U/μL）1 μL、10×ligation buffer 1 μL（終濃度為1×），用dd H2O補至10 μL，最適連接溫度為 16 ℃，時間為1～3 h或過夜；將連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取白色單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp+）[JP2]中，37 ℃、220 r/min 下振蕩培養(yǎng)5～6 h；取2 μL菌液作模板，利用pBARKS1-eGFP載體上的通用引物T3/T7和特異引物MGF/MGR進行PCR檢測；選取PCR檢測陽性的單克隆測序；將測序正確的陽性克隆命名為pBARKS1-MR-eGFP。

2 結果與分析

2.1 玉米大斑病菌總RNA的提取

利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取PD培養(yǎng)7 d的玉米大斑病菌菌體的總RNA，紫外分光光度計測定D260 nm/D280 nm=1.98，濃度為35.7 μg/μL，表明所提取的總RNA質(zhì)量較好、無蛋白質(zhì)、DNA及小分子的污染。瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示28S、18S、5S特征條帶清晰（圖1），說明總RNA質(zhì)量較好，無降解，可以用于cDNA第一鏈的合成。

2.2 基因ORF序列的擴增

利用 基因序列的酶切位點，結合載體質(zhì)粒pBARKS1-eGFP上的多克隆位點，最終選用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和SmaⅠ，設計1對帶有酶切位點的特異引物，以反轉錄的cDNA為模板，擴增 基因ORF序列，得到3 021 bp的條帶，與預期大小相符（圖2）。

2.3 pBARKS1和pBARKS1-eGFP載體的酶切驗證

提取pBARKS1載體質(zhì)粒，用NotⅠ和SmaⅠ進行雙酶切，得到線性質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示有單一的 4 500 bp 條帶（圖3-A）；提取pBARKS1-eGFP載體質(zhì)粒，用EcoRⅠ和SacⅠ進行雙酶切，得到線性載體pBARKS1和GFP片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示有4 500、720 bp 等2條條帶（圖3-B）。說明pBARKS1-eGFP質(zhì)粒載體正確。

2.4 回復載體的構建

將PCR產(chǎn)物分別和pBARKS1-eGFP用NotⅠ和SmaⅠ進行雙酶切，回收目的片段后將帶有相同黏性末端的PCR產(chǎn)物和線性的pBARKS1-eGFP連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，轉化后選擇白色單克隆進行菌液檢測，引物用載體通用引物T3/T7和特異引物MGF/MGR進行PCR擴增驗證，挑取陽性克隆進行測序，結果正確，得到pBARKS1-MR-eGFP重組載體（圖4）。載體pBARKS1-MR-eGFP全長約8 241 bp，NotⅠ與SmaⅠ雙酶切得到大小為5 220、3 021 bp的條帶，結果均與預期大小相符（圖5），玉米大斑病菌黑色素調(diào)控基因 的基因回復表達載體構建成功。

3 結論與討論

目前，隨著DNA測序技術的飛速進步，很多絲狀真菌已經(jīng)完成了基因組測序工作，對其研究已步入后基因組時代，分析和確定基因的功能及關聯(lián)性正成為分子生物學及遺傳學研究[CM（25]的熱點 [13]。研究真菌基因功能的方法有很多種，如基因敲[CM）]

除/置換（gene knockout ）、RNA干擾（RNA interference，RNAi）、基因標記（gene tagging）、基因超表達（over expression）、體外轉座子標記（in vitro transposon tagging）、異源表達（heterologous expression）和酵母雙雜交（yeast two-hybrid system）等?；蚯贸夹g是一種遺傳工程修飾技術，某個基因一旦被確定有研究價值，往往最為直接的方式之一就是將其從基因組中敲除或置換，而后測定相關指標，明確其功能 [14]。該技術是通過同源重組的方法將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位置，經(jīng)過外源DNA序列與靶細胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組或置換，達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的，從而改變細胞的遺傳特性 [15]。回復突變（reverse mutation）指基因缺失突變體經(jīng)過第2次突變又完全或部分恢復為原來的基因型和表現(xiàn)型，基因超表達指目的基因的全長序列與高活性組成型啟動子或組織特異性啟動子融合，通過轉化，獲得該基因編碼產(chǎn)物大量積累，這2種技術的應用更豐富了基因功能研究的證據(jù)。研究方案中通常會設計創(chuàng)制基因敲除突變體、回復突變體和超表達突變體。筆者所在實驗室前期克隆到玉米大斑病菌黑色素合成調(diào)控基因 序列，并創(chuàng)制了基因敲除突變體（結果待發(fā)表），在此基礎上，本試驗構建了含有色氨酸強啟動子、綠色熒光蛋白編碼基因GFP和草胺磷抗性基因bar的回復載體pBARKS1-MR-eGFP，可將重組的載體通過PEG介導轉化玉米大斑病菌黑色素合成基因 缺失突變體的原生質(zhì)體，或玉米大斑病菌野生型菌株的原生質(zhì)體，利用草胺磷抗性培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)獲得草胺磷抗性轉化子，通過分析bar基因、GFP基因及2個同源臂DNA序列設計特異引物，對轉化子進行PCR初步篩選，將篩選的轉化子用bar基因和GFP基因為探針進行Southern blot驗證是否為該基因的回復突變體或超表達突變體，并對該突變菌株進行各項研究分析，如表型分析，附著胞形成能力及穿透能力、毒素產(chǎn)生能力、分生孢子萌發(fā)及突變菌株的侵染能力等，從而對 基因功能進行深入研究。另外，該載體含有綠色熒光蛋白基因GFP，在生物體內(nèi)可以表達綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡（熒光共聚焦顯微鏡）定位目的蛋白的位置。

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