精子DNA完整性和 hOGG1 rs1052133與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性研究*

馬 強申 琴焦海燕

1. 寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學與細胞生物學系（銀川 750004）；

2. 川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科； 3. 寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室

精子DNA完整性和 hOGG1 rs1052133與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性研究*

馬 強1，2△申 琴1，3△焦海燕1，3**

1. 寧夏醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳學與細胞生物學系（銀川 750004）；

2. 川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科； 3. 寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室

目的 探討人類8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase，hOGG1）基因rs1052133（Cys326Ser）及精子DNA完整性對原發(fā)性男性不育的影響。方法 收集2011年8月至2012年12月間在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院就診的332例原發(fā)性男性不育患者和329例健康體檢者分別作為病例組和對照組，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測兩組人群hOGG1 rs1052133基因型；采用精子染色質(zhì)擴散實驗（SCD）檢測病例組和對照組精子DNA損傷程度。分析精子DNA完整性與精液參數(shù)的相關(guān)性以及hOGG1 rs1052133不同基因型與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性以及對精子DNA完整性的影響。結(jié)果 原發(fā)性男性不育患者精子DNA碎片指數(shù)（DFI）高于對照組；原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運動精子和非前向運動精子呈負相關(guān)（r =-0.35和-0.13，P＜0.05），與不動精子呈正相關(guān)（r =0.24，P＜0.05）；攜帶hOGG1 rs1052133CC基因型的個體患原發(fā)性少弱精子癥的風險是攜帶GG型個體的1.93倍。rs1052133與吸煙和飲酒與原發(fā)性男性不育的發(fā)病風險無交互作用，同時該位點三種不同基因型的患者間精子DFI差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 原發(fā)性男性不育患者精子DNA完整性降低，并且精子DNA損傷可導致精液質(zhì)量下降，是原發(fā)性男性不育的病因之一。 hOGG1 rs1052133CC基因型可能是原發(fā)性男性不育的危險因素，但該位點可能不影響精子DNA完整性。

人類8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶； 多態(tài)性， 單核苷酸； 不育， 男性

精子發(fā)生是一個連續(xù)的、多步驟的過程，并且持續(xù)存在于內(nèi)源性和外源性活性氧（ROS）如超氧化物陰離子和過氧化氫物質(zhì)中。氧化應(yīng)激可導致精子細胞膜和精子核DNA和線粒體DNA斷裂［1］，通過影響精子質(zhì)量繼而降低男性生育力。然而，精子細胞內(nèi)缺乏一系列的DNA損傷修復系統(tǒng)，根據(jù)不同的DNA損傷類型，機體啟動相應(yīng)的修復途徑完成受損精子DNA的修復，其中堿基切除修復是主要的修復途徑之一。

人類8-羥基鳥嘌呤糖苷酶1（hOGG1）是堿基切除修復途徑中的關(guān)鍵酶，它具有糖苷酶和脫嘌呤或脫嘧啶裂解酶雙重活性，能特異地切除DNA氧化性損傷的特異性產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤［2］。hOGG1基因表達具有組織特異性，在人類睪丸和胚胎組織中表達最高，對于防止精子基因突變和胚胎免受氧化損傷是必不可少的［3］。人類hOGG1基因中存在較多的多態(tài)性位點，其中rs1052133（G/C，Cys/Ser）是目前研究較多的一個，但其主要集中在與腫瘤的遺傳易感性方面［4-7］，鮮見其與原發(fā)性男性不育的研究。因此，本研究主要探討精子DNA損傷及hOGG1基因 rs1052133對原發(fā)性男性不育的影響，為原發(fā)性男性不育的病因?qū)W研究及預(yù)防提供依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象納入

按照知情同意原則，收集2011年8月至2012年12月間在寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院就診的332例原發(fā)性男性不育患者和329例健康體檢者（均有自然生育史），其中原發(fā)性不育患者包括非梗阻性無精子癥87例、少弱精子癥166例和精液正常的男性不育79例。采集所有研究對象2mL靜脈血，收集上述不育患者和30例正常生育男性（對照組）精液一份，并調(diào)查其吸煙、飲酒狀況。

二、精液常規(guī)分析

按照《WHO人類精液檢驗與處理實驗室手冊（第五版）》的要求，采用全自動精子分析系統(tǒng)檢測原發(fā)性男性不育患者和對照組精子濃度、精子活力等精液常規(guī)參數(shù)。

三、精子DNA損傷程度檢測

運用精子染色質(zhì)擴散實驗［8］檢測少弱精子癥和精液正常不育患者的精子DNA損傷程度。計數(shù)300個以上精子細胞，觀察精子光暈大小。根據(jù)光暈與精子頭部橫徑的比例，粗分為大、中、小和無光暈4個等級。小光暈以精子頭直徑≤1/3為判斷標準；中光暈精子頭直徑＞1/3，而≤2/3；大光暈精子頭直徑＞2/3。大和中光暈表示精子DNA完整無碎片，小和無光暈表示精子DNA斷裂為碎片。精子DNA損傷程度用精子DNA碎片指數(shù)（DFI）表示，DFI=（小光暈精子數(shù)+無光暈精子數(shù)）/總數(shù)×100%。

四、hOGG1 rs1052133基因型分析

采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測不育患者和健康體檢者hOGG1基因 rs1052133位點基因型。

（一）血液基因組DNA提取

用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組提取試劑盒，嚴格按照說明書步驟提取研究對象的血液基因組DNA，儲存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

（二）PCR擴增

［9］報道的引物序列（Forward Primer：5′-TTGCCTTCGGCCCTGTTCCCCAAGGA-3′，Reverse Primer：5′-TTGCTGGTGGCTCCTGAGCA TGGCCG-3′）擴增包含rs1052133位點在內(nèi)的一段DNA序列。擴增體系（12.5μL）：2×Master Mix 6.25μL，Taq DNA polymerase（5U/μL）0.125μL，F(xiàn)orward Primer（10μmol/L）0.25μL，Reverse Primer（10μmol/L）0.25μL，DNA Template 1μL，ddH2O 4.625μL。擴增條件：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，34 Cycles ；72℃ 10min。擴增產(chǎn)物儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（三）RFLP 技術(shù)檢測原發(fā)性男性不育組和對照組hOGG1 rs1052133基因型

采用NEB公司生產(chǎn)的MspⅠ限制性內(nèi)切酶，嚴格按照說明書步驟對上述PCR產(chǎn)物進行酶切。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物進行電泳，并在Syngene 凝膠成像儀下觀察并記錄結(jié)果，判斷基因型。

五、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、精液常規(guī)參數(shù)

如表1所示，少弱精子癥組患者精子濃度和前向運動精子百分數(shù)均低于精液正常不育組和對照組，而非前向運動精子和不動精子百分數(shù)高于精液正常不育組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而精液正常不育組和對照組相比，精子濃度、前向運動精子、非前向運動精子和不動精子百分數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。

二、精子DNA損傷程度

少弱精子癥組、精液正常不育組和對照組中，精子DFI分別為（50.0±22.1）%、（38.2±20.7）%和（21.4±9.2）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

三、原發(fā)性男性不育患者精子DFI與精子活力的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運動精子百分率和非前向運動精子百分率呈負相關(guān)（r =-0.35和-0.13，P＜0.05），與不動精子百分率呈正相關(guān)（r =0.24，P＜0.05），見圖2。

表1 少弱精子癥組和精液正常不育組精液常規(guī)參數(shù)

圖1 原發(fā)性男性不育組和對照組精子DFI比較（%）（P＜0.05）

圖2 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運動精子、非前向運動精子和不動精子的相關(guān)性A: 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與前向運動精子的相關(guān)性； B: 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與非前向運動精子的相關(guān)性； C: 原發(fā)性男性不育患者精子DFI與不動精子的相關(guān)性

四、hOGG1 rs1052133與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性研究

（一）hOGG1 rs1052133位點PCR擴增及PCRRFLP進行基因型分析

參考文獻合成PCR引物（上海生工生物工程有限公司合成），其中上游引物為5′-TTGCCTTCGGC CCTGTTCCCCAAGGA-3′，下游引物為5′-TTGCT GGTGGCTCCTGAGCATGGCcG-3′，PCR反應(yīng)體系（12.5μL）為：2× Master Mix 6.25μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.125μL，上游引物（10μmol/L）0.25μL，下游引物（10μmol/L）0.25μL，ddH2O 4.625μL，DNA模板（50ng/μL）1μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；72℃10min。PCR擴增產(chǎn)物中，若rs1052133位點為C時，則能被MspⅠ酶識別并切開；若rs1052133位點為G時，則不能被MspⅠ酶識別。因而，rs1052133 PCR擴增產(chǎn)物酶切孵育后可產(chǎn)生168bp、142bp、26bp三個片段，根據(jù)電泳結(jié)果判斷基因型（圖3）：CC型142bp、26bp，CG型168bp、142bp、26bp，GG型168bp。由于26bp片段太小，電泳時已經(jīng)泳出瓊脂糖凝膠，無法觀察到。每種基因型的個體各挑選2例，PCR擴增，將擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行測序驗證，結(jié)果顯示，酶切分型和測序完全一致，提示酶切分型結(jié)果可靠。

圖3 rs1052133經(jīng)BslⅠ酶切后電泳圖M泳道: DNA maker； 1， 2泳道: GG基因型； 3， 6泳道: CC基因型； 4，5泳道: CG基因型

（二）hOGG1 rs1052133與原發(fā)性男性不育的相關(guān)性

原發(fā)性男性不育組和對照組中hOGG1 rs1052133三種基因型頻率分布具有顯著性差異（P＜0.05），攜帶CC基因型的個體患原發(fā)性男性不育的風險是攜帶GG型的個體的1.81倍（OR=1.81，95%CI：1.10-3.00）；而G、C等位基因頻率在兩組中的分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。進一步的分層分析發(fā)現(xiàn)，hOGG1 rs1052133與無精子癥和精液正常的男性不育無相關(guān)性，與原發(fā)性少弱精子癥顯著相關(guān)，攜帶CC基因型的個體患原發(fā)性少弱精子癥的風險是GG型個體的1.93倍（表2）。

五、hOGG1 rs1052133不同基因型間精子DFI比較

分析顯示，攜帶rs1052133 GG、CG、CC三種不同基因型個體間精子DFI分別為（48.1±22.4）%、（43.3±21.8）%和（48.8±23.1）%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4）。

六、hOGG1 rs1052133與吸煙飲酒的交互作用對原發(fā)性男性不育的影響

通過單純病例研究發(fā)現(xiàn)，hOGG1 rs1052133與吸煙和飲酒對原發(fā)性男性不育的發(fā)病風險無交互作用（P＞0.05）。

表2 hOGG1 rs1052133與原發(fā)性少弱精子癥的相關(guān)性

圖4 攜帶rs1052133三種不同基因型的個體精子DFI比較

討 論

精子是遺傳物質(zhì)的攜帶者，其質(zhì)量對受精能力和胚胎質(zhì)量均有較大的影響［10，11］。臨床上常用的評價精子質(zhì)量的指標有精子濃度、精子活力、精子活率和精子形態(tài)等，但這些指標不能完全反映精子質(zhì)量。在體內(nèi)，精子會受到睪丸內(nèi)外因素的影響而造成DNA斷裂，如果受損精子DNA得不到及時有效地修復，則可導致男性生育力下降，甚至不育。本研究結(jié)果表明，原發(fā)性男性不育患者精子DNA損傷程度高于生育男性，并且其精子DFI與前向運動精子百分率和非前向運動精子百分率呈負相關(guān)，與不動精子百分率呈正相關(guān)，提示不育患者精子DNA完整性降低，并且隨著精子DFI增高，精子活力呈下降趨勢，與文獻報道的一致［12，13］，因此，精子SCD實驗可作為評價精子質(zhì)量的新指標。

精子DNA在受到體內(nèi)外有害物質(zhì)的損傷后，機體會啟動DNA損傷動修復系統(tǒng)，其中最重要的是堿基切除修復和核苷酸切除修復。人類基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）是第三代遺傳標記，同時它也是不同個體基因功能差異的重要遺傳學基礎(chǔ)。人類DNA損傷修復基因的SNP可能會影響其蛋白功能，導致不同個體修復能力不同，使其修復受損DNA的能力下降，導致基因組完整性降低而影響細胞功能。男性精子DNA損傷可表現(xiàn)為精子質(zhì)量下降，受精能力降低，甚至不育。hOGG1基因rs1052133可以導致Ser/Cys氨基酸改變，影響hOGG1酶的活性，降低其DNA修復能力。rs1052133是腫瘤遺傳易感性研究的熱點，單個研究和Meta 分析均顯示其與多種腫瘤相關(guān)［14-18］，然而rs1052133與男性不育的研究較少見。Ji等［19］的研究表明，在顯性遺傳模型下，rs1052133CG+GG基因型的個體患原發(fā)性男性不育的風險增加。而本研究顯示，攜帶rs1052133CC基因型的個體患原發(fā)性男性不育的風險是GG基因型的1.81倍（OR=1.81，95%CI=1.10-3.00）。本研究結(jié)果與Ji等的結(jié)果相反，可能主要由于研究對象的納入差異。Ji等的病例組納入了620例原發(fā)性男性不育患者，未納入無精子癥患者，而本研究的病例組中包含了87例無精子癥患者。此外，本研究與hOGG1 rs1052133位點的功能學研究也有所不同。研究發(fā)現(xiàn)［20］，OGG1-Ser326（CC）轉(zhuǎn)導細胞比OGG1- Cys326（GG）轉(zhuǎn)導細胞能更高效地抑制8-oxo-Gua 誘導的突變，因此人細胞OGG1-Cys326 修復8-oxo-Gua 所致突變的能力弱于OGG1-Ser326，而本研究顯示在群體水平hOGG1 rs1052133CC基因型是原發(fā)性男性不育的危險因素。

本研究也表明，雖然hOGG1 rs1052133 CC基因型是原發(fā)性男性不育的危險性因素，但是與CG、CC兩種基因型相比，CC基因型患者的精子DFI并無差異，提示hOGG1 rs1052133對精子DNA損傷程度無影響。同時，hOGG1 rs1052133位點與吸煙和飲酒對原發(fā)性男性不育無交互作用。DNA損傷修復是一個復雜的通路，其中涉及到多條信號通路和多個關(guān)鍵基因的共同作用，本研究所選擇的位點可能起微效作用，其他基因的共同作用可能參與了精子DNA損傷的修復。因此，其他DNA損傷修復相關(guān)基因的SNP位點與精子DNA損傷的關(guān)系還有待于進一步的研究。

參 考 文 獻

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（2015-07-28收稿）

Correlation analysis of sperm DNA integrity/hOGG1 rs1052133 and primary male infertility*

Ma Qiang1，2△， Shen Qin1，3△， Jiao Haiyan1，3**
1. Department of Medical Genetics and Cell Biology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；
2.Department of Clinical Laboratory， Affi liated Hospital of North Sichuan Medical College；
3. Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education， Ningxia Medical University

Jiao Haiyan， E-mail: hyjiao1602@hotmail.com

Objective To study the effect of human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase （hOGG1）SNP rs1052133 and sperm DNA integrity on primary male infertility. Methods Based on case-control and case-only study design， polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms （PCR-RFLP） was used to measure the genotypes of rs1052133 among 332 primary male infertility patients and 329 controls. Sperm chromatin depression （SCD）test was used for the examination of sperm DNA integrity. The correlation between sperm DFI and sperm parameters as well as the effect of different rs1052133 genotypes to the genetic susceptibility of male infertility and DFI were analyzed. Results The DFI of primary male infertility was higher than that of fertile man， and DFI negatively correlated with the ratioof forward motile sperm and the ration of non-forward motile sperm（r = -0.35 and -0.13， P＜0.05）， but positively correlated with immotile sperm （ r =0.24， P＜0.05） . The risk of rs1052133 CC genotype carriers were 1.93 fold higher than that of rs1052133 GG genotype. What’s more， there were no interaction effect between male infertility and cigarette smoking and alcohol consumption as well as no signifi cant difference in sperm DFI among these three genotypes. Conclusion The sperm DNA integrity in male infertility patients were lower than that of fertile men. Sperm DNA damage which signifi cant negative correlated with sperm quality was a cause of primary male infertility. Although the CC genotype of hOGG1 rs1052133 was associated with an increased risk of male infertility， it may be not associated with sperm DNA integrity.

human 8-hydroxyguanine deoxyribonucleic acid glycosidase； polymorphism， Single nucleotide；infertility， male

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.004

R 698.2

△共同第一作者

資助: 寧夏自然科學基金項目（ NZ14070）

**通訊作者， E-mail: hyjiao1602@hotmail.com