不明原因不育患者精子頭部空泡超微結(jié)構(gòu)研究*

葛少欽葛雪凝趙崢輝王 燕△劉梅云

1. 河北大學(xué)（保定 071000）； 2. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院；

3. 河北大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究所； 4. 河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院

·研究簡(jiǎn)訊·

不明原因不育患者精子頭部空泡超微結(jié)構(gòu)研究*

葛少欽1-4葛雪凝1趙崢輝1王 燕1△劉梅云2△

1. 河北大學(xué)（保定 071000）； 2. 河北大學(xué)附屬醫(yī)院；

3. 河北大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究所； 4. 河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院

研究表明，不孕不育夫婦數(shù)量正逐步增加［1］，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界大約有15%～20%的育齡夫婦存在生育障礙，而男性原因?qū)е虏挥谋壤?0%～50%［2］。其中精子形態(tài)異常、精子畸形率增加是導(dǎo)致男性不育的重要原因［3］。當(dāng)前許多學(xué)者試圖從精子頂體畸形、精子DNA斷裂與損傷、精子染色體異常等評(píng)價(jià)精子頭部空泡與精子功能缺陷的關(guān)系［4］，但至今精子頭部空泡分類并沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，空泡的本質(zhì)尚屬未知領(lǐng)域。本文利用透射電鏡，觀察正常生育力男性和不明原因不育患者精子頭部空泡超微結(jié)構(gòu)，對(duì)比常規(guī)電鏡包埋材料與僅用戊二醛固定和醋酸鈾染色處理的電鏡材料，分析精子頭部空泡化學(xué)組成，在一定程度上明確精子頭部空泡對(duì)精子質(zhì)量影響的本質(zhì)，探討不明原因性不育患者的不育原因。

材料與方法

一、受試對(duì)象

在河北大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科隨機(jī)選取25～45周歲不明原因的不育患者8例，無(wú)特殊病史，體格檢查正常，無(wú)輸精管阻塞、腮腺炎病毒感染、隱睪、營(yíng)養(yǎng)不良、內(nèi)分泌紊亂和精索靜脈曲張等，精液液化正常，抗精子抗體陰性；女方皆為原發(fā)不孕，經(jīng)婦科B超、子宮輸卵管造影、內(nèi)分泌水平、抗精子抗體、抗心磷脂抗體及抗內(nèi)膜抗體檢查，結(jié)果均正常；對(duì)照隨機(jī)選取結(jié)婚2年、孕育有孩子的正常生育男性3例。

二、標(biāo)本采集和處理

禁欲3～7d，室溫約25～30℃的實(shí)驗(yàn)室，由供精者按摩取精。精液液化后，依據(jù)第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè)》［5］標(biāo)準(zhǔn)行精液常規(guī)檢查，剩余精液450×g，離心10min，沉淀精子用瓊脂糖進(jìn)行預(yù)包埋，一部分用于常規(guī)電鏡材料處理（雙染），另一部分用于戊二醛單固定和醋酸鈾單染電鏡材料處理（單染）。

（一）常規(guī)電鏡材料處理（雙染）

1. 前固定：瓊脂糖預(yù)包埋精子放入裝有適量前固定液1mL的小離心管中進(jìn)行固定。固定液為2.5%多聚甲醛+0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液，于4℃固定2h。

2. 漂洗：4℃下，0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液漂洗3次，每次10min。

3. 后固定：固定液為1%的鋨酸+ 0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液，于4℃固定1h。

4. 再漂洗：4℃下，0.1mol/L、pH 7.2的PBS緩沖液漂洗3次，每次10min。

5. 酒精系列脫水：在30%、50%、70%、85%、95%酒精中各10min，再在100%酒精、丙酮各兩次，每次10min。

6. 滲透：環(huán)氧樹(shù)脂Epon812與丙酮按1:1混合對(duì)材料進(jìn)行滲透2h，然后轉(zhuǎn)入純環(huán)氧樹(shù)脂Epon812滲透，過(guò)夜。

7. 包埋聚合：環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋，60℃聚合48h。

8. 超薄切片：半薄切片定位后，超薄切片（70～90）nm撈在銅載網(wǎng)上。

9. 雙染：對(duì)材料進(jìn)行醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色。

10. 漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次1min，自然干燥。

11. 觀察：用JEM-100SX透射電鏡（75kV）對(duì)材料進(jìn)行觀察，拍照。

（二）戊二醛單固定醋酸鈾單染電鏡材料處理（單染）

1. 前固定：瓊脂糖預(yù)包埋精子放入裝有適量前固定液的1ml的小離心管中進(jìn)行固定。固定液：2.5%多聚甲醛+0.1mol/L pH 7.2的PBS緩沖液，于4℃固定2h。

2. 漂洗：4℃下，0.1mol/L pH 7.2的PBS緩沖液漂洗3次，每次10min。

3. 酒精系列脫水：在30%、50%、70%、85%、95%酒精中各10min，再在100%酒精、丙酮各兩次，每次10min。

4. 滲透：環(huán)氧樹(shù)脂Epon812與丙酮按1:1混合對(duì)材料進(jìn)行滲透2h，然后轉(zhuǎn)入純環(huán)氧樹(shù)脂Epon812滲透，過(guò)夜。

5. 包埋聚合：環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋，60℃聚合48h。

6. 超薄切片：半薄切片定位后，超薄切片（70～90nm）撈在銅載網(wǎng)上。

7. 單染：對(duì)材料進(jìn)行醋酸鈾染色。

8. 漂洗：雙蒸水漂洗3次，每次1min，自然干燥。

9. 觀察：用JEM-100SX透射電鏡（75kV）對(duì)材料進(jìn)行觀察，拍照。

結(jié) 果

依據(jù)第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè)》［5］，精液參數(shù)參考值下限：精液體積1.5 mL，精子濃度15×106/mL，總活力［前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）+非前向運(yùn)動(dòng)精子（NP）］ 40%，PR 32%，存活率58%，正常形態(tài)4%，pH≥7.2，液化時(shí)間（min）≤60，同時(shí)達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者為正常精液。

8例不明原因不育患者和3例正常生育力男性精液常規(guī)分析，其參數(shù)都在正常范圍內(nèi)（表1）；常規(guī)處理的電鏡材料，精子頭部空泡中清晰可見(jiàn)FP、膜螺旋體（MW）和髓樣體（MB），顆粒物質(zhì)與膜結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核電子密度較高，頂體深染（圖1AD）；僅用戊二醛固定、醋酸鈾單染處理的電鏡材料，精子頭部空泡中無(wú)顆粒物質(zhì)與膜型結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核電子密度低，頂體著色淺（圖1E，圖1F）。

表 1 8例不明原因不育患者和3例正常生育力男性精液分析結(jié)果

圖1 電鏡下觀察不育患者精子頭部空泡超微結(jié)構(gòu)A-D為常規(guī)處理的電鏡觀察材料； E、F為僅用戊二醛固定、醋酸鈾單染處理的觀察材料； 其中A: 含有高電子密度絮狀顆粒（FP）物質(zhì)的無(wú)膜空泡和沒(méi)有具體結(jié)構(gòu)、無(wú)膜的小空泡（箭頭所指）； B: 包含膜螺旋體（MW）和絮狀顆粒FP內(nèi)含物的空泡； C: 包含膜螺旋體MW空泡； D: 包含膜螺旋體MW與髓樣體（MB）的空泡； E， F: 戊二醛固定和醋酸鈾染色處理材料精子， 精子頭部空泡（V）無(wú)膜結(jié)構(gòu)（MW/MB）與FP， 內(nèi)含物電子密度低

討 論

精子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能異常是男性不育的重要原因之一。精子形態(tài)學(xué)檢查在輔助生殖技術(shù)中具有重要意義，第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè)》對(duì)精子正常形態(tài)有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)［5］。目前臨床上一直把精液常規(guī)作為男性生殖學(xué)檢查的一項(xiàng)重要而又基本的指標(biāo)，鑒于其局限在光鏡下觀察，無(wú)法對(duì)精子結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷。在臨床精液分析中，特別是對(duì)于一些原因不明的不育癥患者，常規(guī)精液分析參數(shù)正常并不能完全反映其疾病原因信息。透射電鏡基于其高分辨率，能夠清晰觀察精子的各種超微結(jié)構(gòu)，可對(duì)光學(xué)顯微鏡無(wú)法觀察到的精子病變加以識(shí)別，在精子質(zhì)量評(píng)價(jià)中，具有光鏡無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，是目前精子形態(tài)與結(jié)構(gòu)檢測(cè)最客觀可信的依據(jù)［5］。

精子結(jié)構(gòu)完整性是其生殖功能的基礎(chǔ)，精子形態(tài)及結(jié)構(gòu)檢查對(duì)臨床男性不育的診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要意義。通過(guò)對(duì)正常生育力男性和不明原因不育患者常規(guī)電鏡處理材料研究觀察，發(fā)現(xiàn)正常生育力男性精子頭部長(zhǎng)寬比例合適，質(zhì)膜和頂體完整，線粒體排列有序，微管清晰可見(jiàn)9+2結(jié)構(gòu)，頭部無(wú)或有少量無(wú)具體結(jié)構(gòu)的空泡（圖2）；而不明原因不育患者精子頭部空泡十分多發(fā)，且主要位于精子頭部的前中區(qū)域，并存在異質(zhì)性，按其超微結(jié)構(gòu)可分為5種類型（圖1A-D）：含有高電子密度絮狀顆粒（Flocculent particles， FP）物質(zhì)的無(wú)膜空泡；包含膜螺旋體（Membrane whorls， MW）和絮狀顆粒FP內(nèi)含物的空泡；包含膜螺旋體MW與髓樣體（Myelinbody， MB）的空泡；僅包含膜螺旋體MW的空泡和沒(méi)有具體結(jié)構(gòu)、無(wú)膜的小空泡（箭頭所指），這與Zhang等［6］的研究結(jié)果相一致。一般存在較大頭部空泡的精子細(xì)胞核濃縮程度低且不再呈橢圓形結(jié)構(gòu)，頂體凹凸欠平滑、腫脹或呈波浪形改變（圖1A，圖1C，圖1D）。

圖2 正常生育力男性精子常規(guī)電鏡處理材料（A）與僅用戊二醛固定和醋酸鈾染色處理材料（B）A: 精子頭部長(zhǎng)寬比例合適， 精子質(zhì)膜和頂體完整， 細(xì)胞核存在一個(gè)結(jié)構(gòu)較小的空泡， 尾部線粒體排列整齊， 微管清晰可見(jiàn)， 9+2結(jié)構(gòu)完整； B:精子頭部長(zhǎng)寬比例合適， 精子質(zhì)膜和頂體完整， 細(xì)胞核無(wú)空泡， 尾部線粒體排列整齊， 微管可見(jiàn)， 細(xì)胞核與頂體淺染

分析電鏡材料的處理過(guò)程，各種試劑的搭配運(yùn)用保證了對(duì)生物材料中糖、脂、蛋白質(zhì)及核酸的充分固定與染色。其中戊二醛可固定糖，不固定脂；而鋨酸可固定脂，不固定糖，兩種固定劑都能固定蛋白質(zhì)；醋酸鈾對(duì)核酸物質(zhì)及細(xì)胞膜染色效果好，而檸檬酸鉛適用于對(duì)核糖體、糖原、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)染色，另外與含有還原鋨的物質(zhì)有強(qiáng)親和力。只經(jīng)過(guò)戊二醛單固定材料，在用酒精與丙酮脫水過(guò)程中，脂類物質(zhì)將被抽提。我們將只經(jīng)過(guò)戊二醛單固定和醋酸鈾單染的材料（圖2B；圖1E，圖1F）與常規(guī)電鏡材料（圖2A， 圖1A-D）進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)正常生育力精子細(xì)胞核與頂體淺染，不明原因性不育精子頭部空泡中均無(wú)脂質(zhì)膜環(huán)層與髓樣體，認(rèn)為其中脂類物質(zhì)在脫水過(guò)程中已經(jīng)被抽提掉，僅存在相對(duì)高電子密度的蛋白顆粒物質(zhì)，表明精子頭部空泡包含了脂類、蛋白質(zhì)類與核酸類物質(zhì)。多種研究顯示空泡的發(fā)生與精子形成晚期精-組蛋白替換不完全導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮異常有關(guān)［7，8］。精子空泡可能包含精子形成過(guò)程中本該移除的組蛋白、未參與DNA包裝的精蛋白、調(diào)控精子發(fā)生及早期胚胎發(fā)育的非編碼RNA（如lncRNA）等［9，10］。Garolla等［11-13］研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)選擇出的含有大空泡或幾個(gè)大或小空泡的精子存在高水平的DNA損傷；Hammoud等［14］發(fā)現(xiàn)具有前部或后部空泡的正常精子（大小不定）比無(wú)空泡的正常精子的DNA斷裂水平要高很多（前部空泡15.9%，后部空泡22.5% vs. 無(wú)空泡精子4.1%，前部P＜0.05，后部P＜0.001），表明空泡的大小和部位不同所提示的染色質(zhì)濃縮異常程度和DNA斷裂水平不一。研究已經(jīng)證實(shí)大精子空泡與染色質(zhì)濃縮失敗緊密相關(guān)［8］，其可能造成高水平的精子DNA損傷，導(dǎo)致胚胎發(fā)育過(guò)程中父系基因組表達(dá)異常，無(wú)法在4～8細(xì)胞階段完成對(duì)胚胎基因組的激活，使胚胎發(fā)育停滯等［15］，此外延時(shí)分析表明，與空泡精子發(fā)育成的囊胚相比，無(wú)空泡精子囊胚發(fā)育過(guò)程所需平均時(shí)間最短［16］。

盡管不同精子空泡的大小、數(shù)量和部位不同，其染色質(zhì)濃縮異常程度不同，所造成的DNA損傷水平不一，會(huì)導(dǎo)致精子空泡與染色質(zhì)濃縮異常關(guān)聯(lián)程度的偏倚［12，14］，但電鏡下發(fā)現(xiàn)不明原因不育患者精子頭部空泡十分多發(fā)，提示其染色質(zhì)濃縮失敗，精子DNA存在一定程度的損傷，這可能是不明原因嚴(yán)重少弱精子癥患者不育的原因之一。精子頭部空泡多發(fā)將會(huì)降低受精率、妊娠率和胚胎質(zhì)量，并誘發(fā)高流產(chǎn)率［7］，建議不明原因不育患者增加常規(guī)透射電鏡精子檢查項(xiàng)目，條件允許情況下可選擇頭部無(wú)或/少或/小空泡精子進(jìn)行IMSI（Intracytoplasmic Morphologically Selected Sperm Injection）輔助生殖技術(shù)。至于精子頭部空泡中的具體脂質(zhì)分類、蛋白質(zhì)分布、核酸組成，空泡大小、多少及其存在部位等導(dǎo)致精子功能缺陷的閾值，精子頭部空泡對(duì)受精、胚胎發(fā)育影響的分子機(jī)制等，尚有待于進(jìn)一步研究。

不育，男性； 精子/超微結(jié)構(gòu)

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（2015-06-13收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.014

R 698.2

資助: 河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：H2013201259）；河北省2013留學(xué)回國(guó)人員科研活動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：C2013005002）；國(guó)家第48批“留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金”（編號(hào)：702850515001）

△通訊作者， 王燕， E-mail: wyry2004@163.com； 劉梅云， E-mail: lmydoctor2007@sina.com