桂士良騰 飛曹會(huì)峰遲寶進(jìn)

羅振國(guó)2郭玉剛2杜叢林2崔大偉2吳長(zhǎng)利1**

1. 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿科（天津 300211）；

2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院； 3. 吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院

HHcy大鼠tHcy與陰莖海綿體內(nèi)NOS和H2S的相關(guān)性研究*

桂士良1，2△騰 飛3△曹會(huì)峰2遲寶進(jìn)2

羅振國(guó)2郭玉剛2杜叢林2崔大偉2吳長(zhǎng)利1**

1. 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿科（天津 300211）；

2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院； 3. 吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院

目的 探討甜菜堿（Betaine， Bet）對(duì)高同型半胱氨酸血癥（HHcy）大鼠血漿總同型半胱氨酸（tHcy）及陰莖海綿體內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）、硫化氫（H2S）及勃起功能的影響。方法 選用Wistar雄性大鼠45只，隨機(jī)選出10只為對(duì)照組（A）。其余用3%蛋氨酸喂養(yǎng)，造模成功后的30只，隨機(jī)分為：高同型半胱氨酸組（B）、鹽酸甜菜堿治療組（C）、葉酸、維生素B12治療組（D）。A組給予正常飼料；B組3%蛋氨酸喂養(yǎng)。C組、D組，在喂養(yǎng)3%蛋氨酸的同時(shí)，分別給予Bet和葉酸、維生素B12灌胃。4周后，進(jìn)行APO實(shí)驗(yàn)、大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）的測(cè)定、檢測(cè)tHcy濃度及陰莖海綿體內(nèi)NOS活性及H2S濃度。結(jié)果 與A組比較，B組tHcy升高、陰莖海綿體內(nèi)NOS活性及H2S濃度降低，ICP壓力減低，勃起次數(shù)減少，有差異性，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C、D組與B組比較，tHcy降低、陰莖海綿體內(nèi)NOS活性及H2S濃度增高，ICP壓力增高，勃起次數(shù)增多（P＜0.05），同型半胱氨酸（Hcy）與NOS（rA=-0.857、rB=-0.976 、rC=- 0.903、rD=-0.847）和H2S（rA=-0.857、rB=-0.976、rC=- 0.903、rD=-0.847）均成負(fù)性相關(guān)。C組與D組比較，tHcy降低、陰莖海綿體內(nèi)NOS活性及H2S濃度升高，ICP壓力增高，勃起次數(shù)增加，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 tHcy升高影響陰莖海綿體內(nèi)NOS活性及H2S濃度的降低是引發(fā)勃起功能障礙（Erectile dysfunction ，ED）的機(jī)制之一。Bet是治療HHcy所致ED的有效藥物之一。

甜菜堿； 高同型半胱氨酸血癥； 硫化氫； 一氧化氮合酶； 勃起功能障礙

高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocystinemia，HHcy）是指空腹?fàn)顟B(tài)下血漿總的同型半胱氨酸（tHcy）濃度大于15μmol/L。為心、腦血管疾病及外周血管類(lèi)疾病的危險(xiǎn)因素之一［1］。男性tHcy濃度大于女性，且患HHcy的概率明顯較女性高。陳慶軍等［2］研究HHcy大鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)HHcy與勃起功能障礙（ED）有關(guān)，并提出HHcy是ED的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。所以，我們觀察HHcy狀態(tài)下大鼠陰莖海綿體內(nèi)一氧化氮合酶（NOS）活性及硫化氫（H2S）的變化以及其對(duì)勃起功能的影響，并給與甜菜堿（Betaine， Bet）進(jìn)行干預(yù)治療。本文意在對(duì)HHcy進(jìn)行Bet干預(yù)治療，以觀察tHcy和大鼠陰莖海綿體內(nèi)NOS活性及H2S的變化以及其對(duì)勃起功能的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立

HHcy大鼠動(dòng)物模型的建立：用Wistar雄性大鼠純系2月齡雄性45只（佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體質(zhì)量280g～310g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)取10只為對(duì)照組（A組）給予正常飼料喂養(yǎng)。 余35只給予3%蛋氨酸飼料4周后，取血檢tHcy濃度，tHcy濃度＞（24.15±0.96）μmol/L，即為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分成3組：（1）HHcy大鼠模型組（B組） 繼續(xù)給予3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)；（2）HHcy大鼠Bet治療組（C組） 繼續(xù)給予3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)，每天定時(shí)按照60 mg/（kg?d）的劑量給與Bet，0.3mL水溶液灌胃4周；（3）HHcy大鼠葉酸、B12 治療組（D組） 給予3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)，且定時(shí)給予葉酸 0.5mg/（kg?d）和B12 0.2mg/（kg?d），0.3mL水溶液灌胃。A、B組則給予生理鹽水0.3 mL灌胃4周。

二、方法

（一）Hcy測(cè)定

大鼠內(nèi)眥靜脈采血，分離血漿，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測(cè)定各組的tHcy含量。試劑盒（上海豐翔生物科技公司提供），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作

（二）阿樸嗎啡實(shí)驗(yàn)（APO）

擇一安靜的實(shí)驗(yàn)室，分組將每只大鼠置于玻璃器皿中，在頸項(xiàng)背部皮下注射阿樸嗎啡（Sigma公司）100μg/ kg。注射后觀察30 min，并予以記錄A、B、C、D組陰莖勃起次數(shù)。陰莖頭充血及末端陰莖體露出為勃起1次。

（三）大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓（ICP）的測(cè)定

用戊巴比妥鈉（35mg/kg）腹腔注射麻醉，正中切口，分離下腹下神經(jīng)及盆神經(jīng)和海綿體神經(jīng)通過(guò)電極刺激海綿體神經(jīng)。參數(shù)：頻率：2ms，強(qiáng)度：5V，波寬：25Hz，持續(xù)時(shí)間：1min，間隔5min，共3次。

（四）大鼠陰莖海綿體NOS的測(cè)定

勻漿陰莖海綿體后，取上清液，用ELISA法測(cè)定各組NOS水平，試劑盒購(gòu)自（上海豐翔生物科技公司），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較行方差分析及t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HHcy大鼠模型的建立

3%蛋氨酸飼料喂養(yǎng)4周后，通過(guò)檢測(cè)tHcy濃度和APO實(shí)驗(yàn)建立模型組。A、B兩組tHcy濃度和APO實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行蛋氨酸飼養(yǎng)四周后，B組大鼠的勃起次數(shù)低于正常組，tHcy濃度明顯高于正常組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）； B組大鼠ICP測(cè)定值明顯低于正常組，C組、D組ICP測(cè)定值與B組比較ICP值升高（P＜0.05）；B組與A組比較勃起功能下降，（P＜0.05）。C組、D組與B組比較勃起功能提高（P＜0.05）。與B組比較，C組、D組大鼠tHcy濃度下降（P＜0.05），陰莖海綿體內(nèi)NOS活性、H2S含量升高（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠勃起次數(shù)、ICP 、tHcy 、NOS、H2S的測(cè)定結(jié)果。

二、各組大鼠tHcy和陰莖海綿體內(nèi)NOS、H2S含量數(shù)值與H2S進(jìn)行線(xiàn)性相關(guān)性分析

大鼠tHcy水平和陰莖海綿體內(nèi)NOS、H2S含量成負(fù)性相關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠tHcy值與ICP相關(guān)性分析的相關(guān)系數(shù)

討 論

HHcy是心血管疾病的獨(dú)立致病因素之一，有研究表明［2］，高蛋白，高糖飲食可以引起HHcy。HHcy不僅能降低內(nèi)皮細(xì)胞功能，并可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增生，使血管硬化，促使內(nèi)皮小血栓形成，還可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白，加重粥樣硬化，進(jìn)而導(dǎo)致ED［3］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，HHcy大鼠勃起次數(shù)減少、ICP降低，證實(shí)了上述的理論。目前的研究提示［4］，陰莖的勃起是陰莖海綿體內(nèi)的血管在神經(jīng)和體液系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下進(jìn)行的血流動(dòng)力學(xué)改變的結(jié)果。NO在這個(gè)過(guò)程中擔(dān)任重要的信使作用［5］，是在NOS的調(diào)解下通過(guò)L-Arg-NO-cGMP途徑實(shí)現(xiàn)的。桂士良等［6］在研究糖尿病HHcyED大鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥的大鼠的陰莖海綿體中的NOS的含量減少。由此可見(jiàn)，HHcy可以導(dǎo)致陰莖海綿體中NO含量下降，繼而影響陰莖的勃起。

H2S是繼NO和CO后的又一種氣體信號(hào)分子。在人體中，H2S以結(jié)合形式存在是少于1/5的，余下的則以硫氫化鈉（Sodium hydrosulfide，NaSH）的形式存在。NaSH既能水解又可以與H+結(jié)合，達(dá)到既可以維持在人體中的正常濃度，又可使內(nèi)環(huán)境及pH值平穩(wěn)的作用。因其具有較強(qiáng)的脂溶性，可以穿過(guò)細(xì)胞膜［7］，所以具有NO，CO類(lèi)似的生理作用。H2S可以在細(xì)胞間傳遞信息，通過(guò)各種調(diào)節(jié)和信號(hào)傳導(dǎo)方式引起血管的舒張和平滑肌的松弛［8］。H2S作為第三種氣體信號(hào)分子，對(duì)心血管具有保護(hù)作用。同時(shí)與Hcy聯(lián)系緊密。 可以保護(hù)蛋氨酸代謝過(guò)程中Hcy所引起的血管內(nèi)皮損傷，并對(duì)Hcy所引起的細(xì)胞損害也具有保護(hù)作用。在人體中正常范圍中的H2S對(duì)血管內(nèi)皮系統(tǒng)和平滑肌系統(tǒng)同樣有調(diào)節(jié)作用，與NO，CO關(guān)系密切。H2S與NO，CO一樣在調(diào)節(jié)陰莖勃起過(guò)程中，也擔(dān)任著重要的角色［9-11］。有實(shí)驗(yàn)［12］將大鼠的主動(dòng)脈和硝普鈉一起孵育后，證明H2S濃度依賴(lài)于硝普鈉的濃度增加。再應(yīng)用鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶抑制劑后，給予硝普鈉，則H2S減少。在給予左旋精氨酸抑制劑后，發(fā)現(xiàn)大鼠血壓增高，CSE的活性下降，血漿中的H2S濃度降低。因此，推測(cè)NO對(duì)H2S的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)cGMP途徑，實(shí)現(xiàn)對(duì)CSE的調(diào)節(jié)的，NO可以直接增加CSE的轉(zhuǎn)錄，增加表達(dá)，增強(qiáng)其的活性。當(dāng)大鼠肺動(dòng)脈高壓時(shí)，有人發(fā)現(xiàn)H2S/CSE與NO/NOS的作用為負(fù)性調(diào)節(jié)［13］。這就說(shuō)明，NO和H2S之間的相互作用很復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。

隨著對(duì)ED和陰莖勃起理論研究逐步深入，Srilatha等［14］提出H2S在陰莖勃起中有和NO、CO相似的作用；陰莖海綿體可以將Hcy轉(zhuǎn)化為H2S，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)陰莖勃起的作用。這表明H2S在陰莖勃起中亦擔(dān)任著信使的作用。本實(shí)驗(yàn)中觀察到大鼠陰莖海綿體中H2S濃度的降低與tHcy有相關(guān)性。提示陰莖海綿體中H2S濃度的降低可能是HHcy所致ED的發(fā)病機(jī)制之一。

Bet作為藥物單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物治療HHcy已經(jīng)應(yīng)用于臨床多年。本研究在Bet能否改善HHcy所致的ED方面進(jìn)行了嘗試。有學(xué)者研究2型糖尿病大鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)HHcy與勃起功能障礙有關(guān)，并提出HHcy是勃起功能障礙的發(fā)病機(jī)制之一［6］。Bet可以有效的降低HHcy伴高尿酸癥患者的tHcy濃度［15］。減輕了HHcy對(duì)血管系統(tǒng)，血管內(nèi)皮系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的影響［16］。從而達(dá)到改善HHcy所致ED的陰莖勃起功能的效果。本試驗(yàn)中觀察到，Bet在治療HHcy所致的ED方面優(yōu)于葉酸、維生素B12 。

綜上所述，本研究表明HHcy大鼠tHcy與陰莖海綿體內(nèi)NOS和H2S的具有相關(guān)性，Bet在治療高蛋氨酸飲食引起HHcy的陰莖勃起功能下降時(shí)效果優(yōu)于葉酸、維生素B1，可能是治療HHcy所致的陰莖勃起功能下降的有效手段之一。

1 Kanth VV， Golla JP， Sastry BK， et al. Genetie interactions between MTHFR（C677T）， methionine（A2756G， C2758G）varian with vitamin B12 and folic acid determine susceptibility to premature coronary artery disease in Inian population. J Cardiovase Dis Res 2011； 2（3）: 156-163

2 陳慶軍， 曹會(huì)峰， 張東升， 等. HHcy大鼠陰莖海綿體內(nèi)NOS和CO含量的研究. 中華男科雜志 2008； 14（8）: 701-703

3 Hosoki R， Matsuki N， Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous smooth muscle relaxant in synergy with nitric oxide. Biochem Biophys Res Commun 1997； 237（3）: 527-531

4 Factor SH. More study needed on morning erections and erectile dysfunction. Am J Med 2009； 122（2）: e5

5 Sweazea K，Wslker BR.Antioxidant and vasodiatory effects of heme oxygenase on mesenteric vasoreactivity following chronic hypoxia. Microcirculation 2009； 16（2）: 131-141

6 桂士良， 曹會(huì)峰， 遲寶進(jìn)， 等. 2型糖尿病大鼠血漿同型半胱氨酸與陰莖海綿體內(nèi)NOS和內(nèi)源性CO的相關(guān)性研究. 中華男科學(xué)雜志 2012； 18（2）: 126-129

7 Hu X， Li T， Bi S， et al. Possible Role of Hydrogen Sulfi de on the Preservation of donor rat heart. Transplant Proc 2007； 39（10）: 3024-3029

8 Wang R. Two's company. three's a crowd :can H2S be the third endogenous Gaseous transmitter. FASEB J 2002；16（13）: 1792-1798

9 Al-Hunayan A， Thalib L， Kehinde EO， et al. Hyperhomocy-terinemia is a risk factor for erectile dysfuction in men with adultonset diabetes mellitus. Urology 2008； 71（5）: 897-900

10 Szele FG， Murphy DL， Garrick NA. Effects of fenfi uramine，chloral phenyl piperazine， and other serotonin-related agonists and antagonists on penile erections in nonhuman primates. Life Sci 1988； 43（16）: 1297-1303

11 Pearson RJ， Wilson T，Wang R. Endogenous hydrogen sulfi de and the cardiovascular system: What's the smell all about？ Clin Invest Med 2006； 29（3）: 146-150

12 Zhao W， Zhang J， Lu Y， et al. The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATP channel opener. EMBO J 2001； 20（21）: 6008-6016

13 張清友， 杜軍保， 張春雨， 等. 內(nèi)源性一氧化氮對(duì)低氧大鼠肺動(dòng)脈硫化氫胱硫醚-γ-裂解酶體系的影響. 實(shí)用兒科學(xué)臨床雜志 2003； 18（11）: 865-867

14 Srilatha B， Adaikan PG， Li L， et al. Hydrogen sulfi de: A novel endogenous gasotransmitter facilitates erectile function. J Sex Med 2007； 4（5）: 1304-1311

15 Olthof MR， Verhoef P. Effects of betaine in take on plasma homocysteine concentrations and consequeces for health. Curr Drug Metab 2005； 6（1）: 15-22

16 Craig SA.Betaine in human nutrition. Am J Clin Nutr 2004； 80（3）: 539-549

（2015-06-02收稿）

Relevance study of total homocysteine to NOS and endogenous H2S in penile corpus cavernosum of hyperhomocystinemia rats*

Gui Shiliang1，2△， Teng Fei3△， Cao Huifeng2， Chi Baojin2，Luo Zhenguo2， Guo Yugang2， Du Conglin2， Cui Dawei2， Wu Changli1**
1. Department of Urology， the Second Affi liated Hospital Tianjin Medical College，Tianjin， 300211， China； 2. Department of Urology， the First Affi liated Hospital， Jiamusi University； 3. The Affi liated Hospital， Jilin College of Pharmacy Corresponding author: Wu Changli， E-mail: wucl2003@163，com

Objective To study the effects of Bet on erectile function by total homocysteine， NOS and endogenous H2S in penile corpus cavernosum of hyperhomocystinemia rats. Methods Forty-fi ve Wistar male rates were included in the study. Ten of them were randomly selected as the control group （group A ； n=10） and were normally fed. To develop HHcy rats， other rats were fed with 3% methionine diet， then 30 rats of them were randomly divided into three groups as follows: HHcy rats group （group B， n=10）， Betaine treated group （group C， n=10） and folic acid and vitamin B12 treated group （groupD， n= 10）. Four weeks later， ICP were examined， and the levels of the total plasma homocysteine were measured using cycle enzyme， additionally， NOS activity and H2S concentration was examined in penile homogenate. Results Compared with that of group A， the level of plasma tHcy significantly was increased in group B， but the NOS activity and H2S concentration in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were decreased signifi cantly （P＜0.05）. Compared with that of group B， the level of plasma tHcy was signifi cantly decreased in group C and group D， but the NOS activity，H2S concentration in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were signifi cant increased （P＜0.05）， moreover，tHcy was negatively correlated with NOS activity （rA= -0.857， rB= -0.976， rC= - 0.903， rD= -0.847） and H2S concentrations （rA= -0.857， rB= -0.976， rC= -0.903， rD= -0.847）， respectively. Compared with that of group D， the level of plasma tHcy in group C signifi cantly decreased， whereas， the NOS activity， H2S concentrations in the penile cavernous tissue， the erection and ICP of rats were also decreased （P＜0.05）. Conclusion High level of plasma tHcy， and low NOS activity and H2S level in the penile corpus cavernous may result in the ocurrence of ED. Betaine may be an effective agent that improves the erectile dysfunction.

Betaine； Hyperhomocystinemia； Hydrogen sulphide； Nitric oxide synthetase； erectile dysfunction

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.09.003

R 698.1

△并列第一作者

資助: 黑龍江省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：H2015073）； 黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：12521542）； 佳木斯大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：Sz2013-005）

**通訊作者， E-mail: wucl2003@163，com