徐珍珍 倪萬潮 張香桂 郭琪 徐鵬 沈新蓮

YABBY基因家族屬于鋅指蛋白超家族（Zinc finger super-family）的亞家族，在調(diào)控植物葉和花器官發(fā)育過程中起著重要的作用，是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，與植物形態(tài)建成有關(guān)［1-4］。該基因家族有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，位于N端的C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和位于C端的YABBY結(jié)構(gòu)域，又稱與HMG box相似的“螺旋-環(huán)-螺旋”結(jié)構(gòu)域［5-7］。

目前，在很多植物中都有YABBY基因家族的相關(guān)報(bào)道，在模式生物擬南芥中研究的較為清楚。擬南芥YABBY基因家族有6個(gè)成員：FIL（FILAMENTOUS FLOWER）、CRC（CRABSCLAW）、INO（INNER NO OUTER）（YABBY4）、YAB2（YABBY2）、YAB3（YABBY3）和 YAB5（YABBY5）［8-12］， 擬 南芥YABBY基因家族的6個(gè)成員在其側(cè)生器官發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的作用。FIL參與花器官和葉的發(fā)育［10，13］；CRO 和 INO 基因有一定的組織特異性，CRC參與蜜腺和心皮遠(yuǎn)軸端的發(fā)育，INO基因則在外部珠被的發(fā)育中起著重要的作用［11，14-16］；YAB2、YAB3和YAB5基因主要在擬南芥的營養(yǎng)組織中特異表達(dá)［3，17］。

棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其纖維是紡織工業(yè)重要的天然纖維來源。隨著基因組學(xué)和測序技術(shù)的發(fā)展，二倍體D組雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii L.）、A組亞洲棉石系亞1號（G. arboreum）以及陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1（G. hirsutum L. acc. TM-1）相繼完成了測序工作［18-22］，從而為全基因組范圍內(nèi)分析基因家族奠定了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。當(dāng)前關(guān)于棉花YABBY基因家族的研究，鮮有報(bào)道。本研究利用公布的陸地棉TM-1的基因組數(shù)據(jù)，對YABBY基因家族進(jìn)行全基因組掃描，并進(jìn)一步分析其亞細(xì)胞定位、染色體分布、基序、進(jìn)化關(guān)系和組織表達(dá)情況等，旨在為進(jìn)一步深入探索YABBY基因家族的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

兩份陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1（G. hirsutum L.）蛋白和CDS數(shù)據(jù)：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（http：//cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp）和 Pytozome 網(wǎng)站（http：//www.phytozome.net/）；擬南芥 YABBY 基因家族的氨基酸蛋白序列和陸地棉EST數(shù)據(jù)來自NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）數(shù)據(jù)庫；衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）YABBY基因家族的氨基酸序列來自PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 棉花YABBY基因家族的鑒定與進(jìn)化樹分析 將下載的擬南芥6條YABBY基因家族成員在SMART網(wǎng)站進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，然后在Pfam（http：//pfam.janelia.org/）網(wǎng)站下載鑒定到的YABBY結(jié)構(gòu)域的種子文件（PF04690.9），最終利用HMMER3.1b1程序在TM-1蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索棉花YABBY基因家族成員。

利用MEGA 5.1生物信息軟件對鑒定的TM-1基因組中YABBY基因家族氨基酸序列和擬南芥中6條YABBY基因家族的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，采用鄰接（Neighbor-Joining，NJ）算法構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行1000次Boot strap抽樣。

1.2.2 棉花YABBY基因家族的染色體定位和亞細(xì)胞定位 結(jié)合Perl語言編程，在TM-1基因組數(shù)據(jù)中的gff3文件中提取YABBY基因家族成員的染色體起始和結(jié)束位置，然后利用MapInspect軟件繪制YABBY基因家族的染色體物理分布圖；利用在線軟件 CELLO：Subcellular Localization Predictive System預(yù)測棉花YABBY基因家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.2.3 棉花YABBY基因家族的基序分析 利用MEME軟件分析棉花YABBY基因家族成員的motif類型和排列順序。參數(shù)設(shè)置如下：基序的最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目是10個(gè)，其它參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.4 棉花的YABBY基因家族的組織表達(dá)分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫下載330 520條陸地棉的EST序列。利用Blastn程序，搜索棉花YABBY基因家族成員CDS序列與陸地棉EST序列的匹配，分析棉花YABBY基因家族成員的組織表達(dá)類型，參數(shù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為E≤10-10，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果

2.1 棉花YABBY基因家族的鑒定

通過結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)擬南芥的6條YABBY蛋白的氨基酸序列都含有YABBY結(jié)構(gòu)域。因此，利用Pfam網(wǎng)站中下載的YABBY結(jié)構(gòu)域的種子文件在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索，又在SMART網(wǎng)站進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)和人工校對，最終在TM-1基因組中鑒定到23條YABBY蛋白。根據(jù)一般植物蛋白的命名方法，對鑒定到的23條棉花YABBY蛋白進(jìn)行了命名，并統(tǒng)計(jì)了它們對應(yīng)的蛋白ID號、所在的亞基因組以及對應(yīng)的蛋白長度，從159個(gè)氨基酸到220個(gè)氨基酸不等（表1）。

2.2 棉花YABBY基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

我們以衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作為外類群，利用陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中鑒定的23條YABBY蛋白和擬南芥的6條YABBY蛋白的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。與擬南芥類似，棉花的YABBY基因家族也分為4個(gè)亞組（Ⅰ-Ⅳ），且每個(gè)亞組都有與擬南芥同源的基因：GhYABBY15、GhYABBY5、GhYABBY17、GhYABBY6、GhYABBY8、GhYABBY19、GhYABBY4、GhYABBY16、GhYABBY1和GhYABBY23屬于Ⅲ亞組，與擬南芥AtYABBY5屬于一個(gè)亞組；GhYABBY10、GhYABBY18和GhYABBY7屬于亞組Ⅳ，與擬南芥AtYABBY2屬于一個(gè)亞組；GhYABBY22、GhYABBY12、GhYABBY9、GhYABBY20、GhYABBY11和 GhYABBY21屬于亞組Ⅰ，與擬南芥FIL和AtYABBBY3屬于一個(gè)亞組；GhYABBY3、GhYABBY14、GhYABBY13和 GhYABBY2屬于亞組Ⅱ，與擬南芥CRC和AtYABBY4屬于一個(gè)亞組。

表1 陸地棉TM-1全基因組YABBY基因家族的基本信息

圖1 陸地棉TM-1和擬南芥YABBY基因家族的進(jìn)化樹

2.3 棉花YABBY基因家族的染色體定位和亞細(xì)胞定位

陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中23個(gè)YABBY基因家族成員分布在16條染色體和1條Scaffold上，分 別 為 A01、D01、D02、A03、A04、A05、D05、A06、D06、A07、D07、A09、A11、D11、A12、D12和 Scaffold3715_D01（圖 2）；除了 A07和 D07染色體上分別有3個(gè)成員外，其他染色體上只有1-2個(gè)成員（圖2）；在TM-1的A亞組和D亞組具有成對的平行進(jìn)化同源YABBY基因，分布在D01、A01、Scaffold3715_D01、A05、D05、A07、D07、A11、D11、A12和D12染色體上；共有9對共線性基因，分別為GhYABBY13和GhYABBY2、GhYABBY1和 GhYABBY23、GhYABBY5和 GhYABBY15、GhYABBY6和 GhYABBY17、GhYABBY7和GhYABBY18、GhYABBY8和 GhYABBY19、GhYABBY9和 GhYABBY20、GhYABBY11和 GhYABBY21、GhYABBY12和 GhYABBY22。

圖2 陸地棉TM-1基因組上YABBY基因家族的染色體分布

TM-1基因組中23個(gè)YABBY基因家族成員的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果（表1）表明，13個(gè)YABBY基因家族成員具有1個(gè)亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核或胞外；8個(gè)成員具有2個(gè)亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核和胞外；2個(gè)成員具有3個(gè)亞細(xì)胞定位，定位到細(xì)胞核、胞外和線粒體上。

2.4 棉花YABBY基因家族的基序（motif）分析

棉花的YABBY基因組家族分為4個(gè)亞組（Ⅰ-Ⅳ），23個(gè)YABBY基因家族成員的基序分析結(jié)果顯示，每個(gè)亞組的成員具有相同或類似的基序類型和排列順序，而且9對同線性基因具有相同的基序類型和排列順序（圖3）。GhYABBY15、GhYABBY5、GhYABBY17、GhYABBY6、GhYABBY8、GhYABBY19、GhYABBY4、GhYABBY16、GhYABBY1和GhYABBY23具有相似的motifs（7-8個(gè)），motif排列順序也基本相同；GhYABBY18、GhYABBY10和GhYABBY7具有類似的motifs（4-6個(gè)），排序順序 也 類 似 ；GhYABBY22、GhYABBY12、GhYABBY9、GhYABBY20、GhYABBY11和 GhYABBY21具有完全相同的6個(gè)motifs，而且排列順序完全相同；GhYABBY3、GhYABBY14、GhYABBY13和 GhYABBY2具有相似的4-5個(gè)motifs，排序順序類似。

圖3 陸地棉TM-1基因組上YABBY基因家族的基序類型

2.5 棉花YABBY基因家族的組織表達(dá)分析

TM-1全基因組中的23個(gè)YABBY基因家族成員在棉花的根、莖、葉、花、蕾、幼胚珠、胚珠、纖維、莖端分生組織、分生區(qū)和胚性愈傷組織中廣泛表達(dá)（表2）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有的23個(gè)YABBY基因家族成員在2個(gè)及兩個(gè)以上的組織中表達(dá)；23個(gè)YABBY基因家族成員全部在花、蕾和莖端分生組織中表達(dá)，大部分成員在根、莖和分生區(qū)域表達(dá)，還有部分基因在胚珠和胚性愈傷組織表達(dá)。

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)和基因組學(xué)手段在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1全基因組中共鑒定了23條YABBY基因家族成員，其中有9對為共線性基因（A亞組和D亞組），只有5個(gè)基因不是共線性基因，這與以往的報(bào)道一致，二倍體A組亞洲棉和D組雷蒙德氏棉基因組之間存在很強(qiáng)的共線性［22］；9對共線性基因中，除了GhYABBY9和GhYABBY20、GhYABBY13和GhYABBY2以外，其余7對共線性基因的氨基酸長度完全相同；除了GhYABBY13和GhYABBY2這一對共線性基因外，其余的每對共線性基因具有完全相同的亞細(xì)胞定位；9對共線性基因在進(jìn)化上非常保守，在進(jìn)化樹上分布在相同的分支上；motif分析表明，除GhYABBY13和GhYABBY2外，其余的每對共線性基因具有完全相同的motif類型和排列順序。

擬南芥YABBY基因家族有6個(gè)成員FIL、CRC、AtYABBY4、AtYABBY2、AtYABBY3 和 AtYABBY5，其中每個(gè)成員的功能都已研究得較為清楚［8-12］。進(jìn)化樹分析表明，本研究在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組中鑒定的23個(gè)YABBY基因家族成員與擬南芥一樣，分為4個(gè)亞組，且每一個(gè)亞組都有與擬南芥同源的基因，由此推測，棉花和擬南芥YABBY基因家族成員在功能上可能具有一定的相似性。因此，研究棉花YABBY基因家族成員的功能，在一定程度上可以參考擬南芥的研究結(jié)果。

表2 陸地棉TM-1全基因組YABBY基因家族的組織表達(dá)模式

組織表達(dá)分析（表2）表明，TM-1全基因組中的23個(gè)YABBY基因家族成員具有較為廣泛的組織表達(dá)類型。其中，23個(gè)YABBY基因家族成員全部在花、蕾和莖端分生組織中表達(dá)，這在一定程度上暗示棉花的YABBY基因家族成員可能參與了花、蕾和莖端分生組織的發(fā)育；亞組Ⅰ的6個(gè)成員和亞組Ⅲ的部分成員都在根、莖和分生區(qū)域表達(dá)，這在一定程度上暗示這些基因可能參與了根、莖和分生區(qū)域的發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究從陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1（Gossypium hirsutum L. acc. TM-1）基因組中鑒定到23個(gè)YABBY基因家族成員，具有不同的亞細(xì)胞定位和染色體定位，且具有較為廣泛的組織表達(dá)類型。這些成員分為4個(gè)亞組，每個(gè)亞組成員間具有相似的基序類型和排列順序。

［1］Bowman JL. The YABBY gene family and abaxial cell fate［J］.Curr Opin Plant Biol, 2000, 3（1）：17-22.

［2］Reinhardt D, Frenzm M, Mandel T, et al. Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato［J］. Development, 2005, 132（1）：15-26.

［3］Eckardtn A. YABBY genes and the development and origin of seed plant leaves［J］. Plant Cell, 2010, 22（7）：2103.

［4］Yamada T, Yokota S, Hirayama Y, et al. Ancestral expression patterns and evolutionary diversification of YABBY genes in angiosperms［J］. Plant J, 2011, 67（1）：26-36.

［5］Kanaya E, Nakajima N, Okada K. Non-sequence-specific DNA binding by the FILAMENTOUS FLOWER protein from Arabidopsis thaliana is reduced by EDTA［J］. J Biol Chem, 2002, 277（14）：11957-11964.

［6］Sieber P, Petrascheck M, Barberis A, et al. Organ polarity in Arabidopsis NOZZLE physically interacts with members of the YABBY family［J］. Plant Physiol, 2004, 135（4）：2172-2185.

［7］Golz JF, Roccaro M, Kuzoff R, et al. GRAMINIFOLIZ promotes growth and polarity of Antirrhinum leaves［J］. Development, 2004,131（15）：3661-3670．

［8］Siegfried KR, Eshed Y, Baum SF, et al. Members of the YABBY gene family specify abaxial cell fate in Arabidopsis［J］. Development,1999, 126（18）：4117-4128．

［9］Villanueva JM, Broadhvest J, Hayser BA, et al. INNER NO OUTER regulates abaxial-adaxial patterning in Arabidopsis ovules［J］.Genes Dev, 1999, 13（23）：3160-3169．

［10］Sawa S, Watanabe K, Goto K, et al. FILAMENTOUS FLOWER, a meristem and organ identity gene of Arabidopsis, encodes a protein with a zinc finger and HMG-related domains［J］. Genes Dev,1999, 13（9）：1079-1088．

［11］Bowman JL, Smyth DR. CRABS CLAW, a gene that regulates carpel and nectary development in Arabidopsis, encodes a novel protein with zinc finger and helix-loop-helix domains［J］. Development,1999, 126（11）：2387-2396.

［12］Lee JY, Baum SF, Oh SH, et al. Recruitment of CRABS CLAW to promote nectary development within the eudicot clade［J］.Development, 2005, 132：5021-5032.

［13］Stahle MI, Kuehlich J, Staron L, et al. YABBYs and the transcriptional corepressors LEUNIG and LEUNIG_HOMOLOG maintain leaf polarity and meristem activity in Arabidopsis［J］.Plant Cell, 2009, 21（10）：3105-3118.

［14］Zhang XL, Yang ZP, Zhang J, et al. Ectopic expression of BraYAB1-702, a member of YABBY gene family in Chinese cabbage, causes leaf curling, inhibition of development of shoot apical meristem and flowering stage delaying in Arabidopsis thaliana［J］. J Mol Sci, 2013, 14（7）：14872-14891.

［15］Shamimuzzaman M, Vodkin L. Genome-wide identification of binding sites for NAC and YABBY transcription factors and coregulated genes during soybean seedling development by ChIPSeq and RNASeq［J］. BMC Genomics, 2013, 14（1）：477.

［16］Ha CM, Jun JH, Fletcher JC. Control of Arabidopsis leaf morphogenesis through regulation of the YABBY and KNOX families of transcription factors［J］. Genetics, 2010, 186（1）：197-206.

［17］Sarojam R, Sappl PG, Goldshmidt A, et al. Differentiating Arabidopsis shoots from leaves by combined YABBY activities［J］.Plant Cell, 2010, 22（7）：2113-2130.

［18］Wang KB, Wang ZW, Li FG, et al. The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii［J］. Nat Genet, 2012, 44：1098-1103.

［19］Parerson AH, Wendel JF, Gundlach H, et al. Repeated polyploidization of Gossypium genomes and the evolution of spinnable cotton fibres［J］. Nature, 2012, 492：423-427.

［20］Li FG, Fan GY, Wang KB, et al. Genome sequence of the cultivated cotton Gossypium arboreum［J］. Nature Genetics, 2014, 46（6）：562-574.

［21］Li FG, Fan GY, Lu CR, et al. Genome sequence of cultivatedUpland cotton（Gossypium hirsutum TM-1）provides insights into genome evolution［J］. Nature Biotechnology, 2015, doi：10.1038/nbt. 3208.

［22］Zhang TZ, Hu Y, Jiang WK, et al. Sequencing of allotetraploid cotton（Gossypium hirsutum L. acc. TM-1）provides a resource for fiber improvement［J］. Nature Biotechnology, 2015, doi：10.1038/nbt. 3207