曾長(zhǎng)英 周玉飛 彭明

miRNA（microRNA）是近年來在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源、不編碼蛋白、長(zhǎng)度為 20-24 nt的單鏈小分子 RNA［1］。miRNA能與靶mRNA分子的3'UTR區(qū)特異性配對(duì)，引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因在轉(zhuǎn)錄后水平上的負(fù)向調(diào)控［2］。miR319最初是通過對(duì)jaw-D基因突變體的正向遺傳分析發(fā)現(xiàn)的，它可通過靶向TCP轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控植物葉片的形態(tài)建成與生長(zhǎng)發(fā)育［3］。過表達(dá)miR319基因會(huì)引起植物表型變化，包括植物葉片邊緣鋸齒化、果實(shí)畸形、葉片向上生長(zhǎng)等一系列異常的表型［4］。Schommer［5］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) miR319 還可調(diào)控茉莉酸生物合成，從而調(diào)控植物葉片的衰老進(jìn)程。此外，miR319還在花瓣和雄蕊的發(fā)育過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，如miR319a成熟序列的一個(gè)堿基發(fā)生突變，會(huì)導(dǎo)致miR319功能缺失，引起花瓣變短變窄、雄蕊變短等［6］。

在低溫脅迫下，Sunkar 等［7］發(fā)現(xiàn) miR393和miR319c在擬南芥冷害下強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)；賈蓓［8］通過基因芯片在水稻中發(fā)現(xiàn)miR319a/b在低溫處理0.5h即有表達(dá)量的下調(diào)。Wang等［9］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)miR319b能提高轉(zhuǎn)基因水稻的耐低溫能力，同時(shí)提升轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量和逆境后的成活率。與此同時(shí)，其靶基因OsPCF6和OsTCP21在轉(zhuǎn)基因植株中下調(diào)表達(dá)，推測(cè)miR319b可能是通過活性氧的清除實(shí)現(xiàn)耐低溫能力的提升。

木薯是典型的熱帶塊根作物，其耐低溫能力及特性與擬南芥及以種子為收獲目標(biāo)的水稻可能存在差異，本研究旨在針對(duì)miR319在木薯低溫脅迫過程的響應(yīng)特點(diǎn)做初步的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯品種SC124和C4。

1.2 方法

在室外大田采用種莖繁殖的方法將木薯SC124和C4種植在體積為3 L的塑料盆，每周澆施1/4濃度的霍格蘭大量元素營(yíng)養(yǎng)液和阿農(nóng)微量元素營(yíng)養(yǎng)液，常規(guī)病蟲害管理3個(gè)月后，將盆栽苗移到SANYO人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行低溫處理。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理：馴化處理（acclimation treatment，AT：25℃梯度降溫至14℃后開始計(jì)時(shí)）；馴化后寒害（acclimation hurt，AH：在經(jīng)歷5 d馴化處理后再由14℃梯度降溫至4℃）；非馴化寒害（nonacclimation hurt，NAH ：25℃ 直接降溫 至 4℃） 和對(duì) 照（negative control，NC： 一 直 維 持 25℃ 的溫度）。

4個(gè)處理的前中后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的功能葉混合成4個(gè)樣品：NC（0 d、5 d和 10 d），AT（6h、24h和5 d），AH（6h、24h和 5 d）和 NAH（6h、24h和5 d），這4個(gè)樣品抽提的RNA同時(shí)用于小RNA的定量分析和靶基因的定量分析。miRNA的RT-PCR檢 測(cè) 參 考 Wang 等［10］的 Multiplexed RT-PCR 方法，內(nèi)參基因?yàn)閁6，靶基因的特異引物設(shè)置在跨越miRNA與靶基因結(jié)合區(qū)的前端（5'端）和后端（3'端），內(nèi)參基因?yàn)锳ctin。

2 結(jié)果

2.1 miR319與其靶基因在SC124的4個(gè)處理轉(zhuǎn)錄組中的消長(zhǎng)關(guān)系

前期對(duì)SC124的4個(gè)處理中的根莖葉混合樣品進(jìn)行了小RNA測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，兩組數(shù)據(jù)中miR319a與其靶基因之間的表達(dá)量關(guān)系如表1所示：miR319在NAH中相對(duì)于NC來說下調(diào)表達(dá)了6.6倍，4個(gè)靶基因則是上調(diào)表達(dá)7-155倍之多，涉及的基因有MYB33、TCP4、GSTU8及一個(gè)未知功能基因（以下簡(jiǎn)稱Unknown）。而在其他兩個(gè)低溫處理與對(duì)照的比較中未發(fā)現(xiàn)miR319與其靶基因在表達(dá)量上存在消長(zhǎng)關(guān)系。

表1 miR319與其靶基因在NAH下表達(dá)量上的消長(zhǎng)關(guān)系

2.1 miRNA在兩個(gè)木薯品種中的不同響應(yīng)特征

選取每個(gè)處理前中后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)功能葉混合樣品對(duì)miR319a做的定量分析，結(jié)果（圖1-A）顯示，miR319a在C4和SC124兩個(gè)品種中的4個(gè)處理的響應(yīng)模式一致，均呈“反Z”型。4個(gè)處理的兩兩比較分析（圖1-B）表明，SC124的變化幅度顯著大于C4相應(yīng)處理間的表達(dá)量變化，尤其是在包含NAH處理的比較中，如NAH/NC和NAH/AT，兩品種間的差異最大（圖1-B中兩曲線中間的間隔寬度，分別為2.269和3.21），而在AT/NC（0.941）和AH/NC（0.937）中的差距則要小許多。這一結(jié)果與小RNA測(cè)序結(jié)果中僅在NAH中差異表達(dá)較大相一致。

圖1 四個(gè)處理?xiàng)l件下miR319a與內(nèi)參基因U6的相對(duì)表達(dá)量（A）及兩兩處理間的相對(duì)表達(dá)量（B）

2.2 miRNA與其靶基因在3個(gè)低溫脅迫下的不同響應(yīng)

結(jié)合miR319與其4個(gè)靶基因在同一套樣品中的表達(dá)量變化（圖2）顯示，miR319在C4和SC124兩個(gè)品種的NAH處理中都具有明顯此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相一致，且兩品種間的變化趨勢(shì)相反，說明這一miRNA表達(dá)量上的差異可能在這兩個(gè)木薯品種的耐低溫能力差異上起著重要作用。而在AH處理下，尤其是AT處理下無明顯的規(guī)律。

圖2 miR319a與4個(gè)靶基因在C4和SC124兩個(gè)品種之間的表達(dá)模式

2.3 miRNA與靶基因之間的相關(guān)性分析

將4個(gè)處理中miR319a及其靶基因與NC的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行散點(diǎn)圖分析（圖3），可得出以下擬合方程，miR319a與靶基因之間的相關(guān)系數(shù)表現(xiàn)出一定的變化：C4中miR319a與3個(gè)靶基因（TCP4、MYB33和Unknown）的相關(guān)系數(shù)均大于SC124中miR319a與相應(yīng)靶基因的相關(guān)系數(shù)，而miR319a與GSTU8（5766）的相關(guān)系數(shù)卻是在SC124中大于C4中的相關(guān)系數(shù)。miR319與靶基因的相關(guān)系數(shù)及R2值在兩個(gè)品種中從大到小的順序一致，依次為MYB33＞Unknown＞TCP4＞GSTU8。

圖3 miR319a與其靶基因在兩個(gè)品種中4個(gè)處理間的相關(guān)性分析

3 討論

miRNA在植物中一般是通過對(duì)其靶基因的mRNA進(jìn)行剪切，從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)靶基因的負(fù)向調(diào)控，從我們的研究結(jié)果可以看出，剪切是具有時(shí)間、部位、處理方式及品種特異性。本研究發(fā)現(xiàn)miR319a在C4和SC124兩個(gè)木薯耐低溫能力不同的品種中的4個(gè)低溫脅迫處理表現(xiàn)大體一致，且在SC124中的變化幅度要大于C4中的變化幅度，尤其是在NAH（從正常的25℃直接降到4℃的非馴化低溫傷害處理）中兩個(gè)品種的差別最大。由此可見，miR319a在未經(jīng)過馴化的NAH下品種差異最大，而通過14℃的馴化處理（包括AT和AH），miR319所介導(dǎo)的靶基因調(diào)控在兩個(gè)品種低溫響應(yīng)模式趨于一致。前期表型分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NAH處理下木薯植株在4個(gè)低溫處理中低溫傷害最顯著，且SC124的表型傷害要重于C4的低溫傷害［11］，說明NAH處理下兩品種miR319a表達(dá)量變化某種程度上表征了木薯低溫脅迫的程度。

miR319是目前研究比較深入的植物miRNA，它的靶基因涉及TCP轉(zhuǎn)錄因子和MYB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著植物葉和花的發(fā)育及葉片的衰老。前人研究證明在葉的發(fā)育階段，靶基因TCP轉(zhuǎn)錄因子負(fù)調(diào)控葉的發(fā)育進(jìn)程，而在葉片的衰老階段，靶TCP轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)控葉的衰老進(jìn)程［5，12］。這個(gè)現(xiàn)象與木薯miR319a在低溫脅迫傷害表現(xiàn)最明顯的NAH處理中呈現(xiàn)出與靶基因明顯的消長(zhǎng)關(guān)系不謀而合，因?yàn)樵贜AH處理中的低溫傷害中大量的葉片出現(xiàn)黃化、萎蔫，甚至干枯掉落，是明顯的衰老過程。而對(duì)于AT和AH這兩個(gè)經(jīng)歷了14℃亞低溫馴化過程的處理來說，明顯削弱了miR319對(duì)衰老的正向促進(jìn)作用，起到一種類似于延緩衰老的客觀效果，這與亞低溫馴化減輕低溫脅迫傷害的生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)也是一致的。

由miR319a與4個(gè)不同靶基因的表達(dá)量的擬合方程來看，擬合方程的斜率（即相關(guān)系數(shù)）和R2值（即擬合程度）都不是很顯著，原因之一可能是：僅依靠miR319a一個(gè)成員與其4個(gè)共同的靶基因做消長(zhǎng)關(guān)系的擬合方程可能會(huì)發(fā)生信息轉(zhuǎn)換的不準(zhǔn)確。因?yàn)?miR319家族中有 miR319a、miR319b、miR319c等3個(gè)成員，且3個(gè)成員在葉的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著截然不同的功能［6］，表達(dá)水平各不相同且有部分重疊，解決辦法是用更為特異的stem-loop方法準(zhǔn)確定量miR319的3個(gè)不同成員的表達(dá)量變化，進(jìn)而區(qū)分哪個(gè)miR319成員在哪個(gè)處理下與哪個(gè)靶基因之間具有明顯的消長(zhǎng)關(guān)系。

miR319a與4個(gè)不同靶基因表達(dá)量的擬合方程中的相關(guān)系數(shù)表明，與miR319a相關(guān)系數(shù)從大到小的靶基因依次為MYB33＞Unknown＞TCP4＞GSTU8。本研究組前期工作發(fā)現(xiàn)，在木薯低溫脅迫的NAH處理中檢測(cè)到miR319a對(duì)TCP4（4517）在miRNA與mRNA結(jié)合區(qū)的第8個(gè)堿基處有剪切作用，但miR319的另外一個(gè)基因GSTU8（5766）與miR319匹配區(qū)內(nèi)未檢測(cè)miR319a對(duì)它的剪切事件［13］。這進(jìn)一步驗(yàn)證了miR319a與TCP4的擬合方程中的相關(guān)系數(shù)（-2.793，R2為0.136）也顯著大于miR319a與GSTU8的相關(guān)系數(shù)（-0.091，R2為0.104）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)比經(jīng)典靶基因TCP4，與miR319a的相關(guān)系數(shù)更高的有MYB33和功能未知基因（021030 m）兩個(gè)靶基因，預(yù)示著miR319的靶基因MYB33和Unknown處于更為優(yōu)先的調(diào)控目標(biāo)，MYB33作為miR319的靶基因主要在花的發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，如影響植物雄蕊的育性［14］。但miR319對(duì)MYB33和Unknown的調(diào)控作用在木薯的低溫逆境適應(yīng)性過程中起著怎樣的作用，是下一步值得深入研究的問題。

4 結(jié)論

成功克隆并報(bào)道了miR319a及其4個(gè)不同靶基因在兩個(gè)木薯品種低溫脅迫的響應(yīng)特征，通過miRNA與靶基因之間在不同低溫處理間的比較分析表 明，miR319a對(duì) MYB33和Unknown（021030m）兩個(gè)靶基因的調(diào)控在木薯的低溫適應(yīng)性上有著重要作用，是木薯低溫適應(yīng)性遺傳改良的重要候選基因。

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