徐佳向志雄 萬惠新 夏廣新（上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203）

抗腫瘤候選藥物SPH0396對CYP1A2和CYP3A4的誘導(dǎo)研究

徐佳*向志雄 萬惠新 夏廣新**
（上海醫(yī)藥集團股份有限公司中央研究院 上海 201203）

目的：建立穩(wěn)定高效的原代大鼠肝細胞和凍存人肝細胞誘導(dǎo)實驗?zāi)Ｐ停芯縎PH0396對CYP1A2和CYP3A4的誘導(dǎo)。方法：利用探針底物代謝物生成量對CYP3A4和CYP1A2的酶活性進行評價。結(jié)果：SPH0396在0.1mol/L和1mol/L對CYP酶（1A2和3A4）無誘導(dǎo)作用，3mol/L時對CYP3A4無誘導(dǎo)，而對CYP1A2的誘導(dǎo)倍數(shù)均大于2，初步認為其誘導(dǎo)CYP1A2,且誘導(dǎo)作用在原代大鼠與凍存人肝細胞中無種屬差異。結(jié)論：SPH0396能誘導(dǎo)CYP1A2，需關(guān)注SPH0396因誘導(dǎo)CYP1A2而導(dǎo)致臨床上發(fā)生藥物-藥物相互作用的可能性。

酪氨酸激酶抑制劑 肝細胞 誘導(dǎo)

酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TKs）在許多生理過程中都發(fā)揮重要作用，而TKs的活性失調(diào)被證明與多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。近年來，以酪氨酸激酶為靶點進行藥物研發(fā)已成為國際上抗腫瘤藥物研究的熱點，多種小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）被批準上市用于腫瘤治療[1-2]。針對Bcr-Abl靶點，我院設(shè)計并合成了一系列化合物，并對其中部分化合物進行了體外藥效學(xué)和早期代謝性質(zhì)的評價。其中SPH0396（圖1）在激酶和細胞水平的抗腫瘤活性均接近或優(yōu)于上市藥物bosutinib[3-5]，體內(nèi)外藥代性質(zhì)良好，因此將其選為候選化合物進一步研究。

圖1 SPH0396的化學(xué)結(jié)構(gòu)

藥物間的相互作用（drug-drug interactions，DDI）指的是某種藥物的作用時間或者作用強度在與其他藥物同時服用時發(fā)生了藥效學(xué)和藥代學(xué)上可以量化評價的變化。藥代動力學(xué)方面的DDI很難被發(fā)現(xiàn)：絕大多數(shù)的藥物通過腸道和/或肝細胞色素P450酶代謝，在被代謝酶抑制或誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)運的的過程中，可能發(fā)生DDI[6]。近20年來，美國FDA已先后將批準上市的數(shù)十種新藥從市場撤出，其主要的原因就是出現(xiàn)了嚴重的藥物代謝性相互作用。誘導(dǎo)CYP450酶的表達或功能上調(diào)，加快藥物的代謝速率影響臨床療效或引起中毒。誘導(dǎo)的主要作用機制是通過核受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，其中芳香烴受體（AhR）介導(dǎo)CYP1A2，孕烷X受體（PXR）介導(dǎo)CYP3A、CYP2C、CYP2B，組成型雄甾烷受體（CAR）介導(dǎo)CYP2B6[6-8]。因CYP2B6誘導(dǎo)劑苯巴比妥為管制藥品，且CYP3A、CYP2C、CYP2B為同一受體介導(dǎo)，新藥早期誘導(dǎo)作用的評價選擇CYP1A2和CYP3A4。

早期誘導(dǎo)作用評價可以避免在漫長的藥物研發(fā)過程中因為誘導(dǎo)造成大量問題沒有得到及時發(fā)現(xiàn)和解決而造成的損失。體外肝細胞培養(yǎng)作為觀察藥物是否對肝微粒體酶亞型有誘導(dǎo)作用的體外實驗?zāi)Ｐ?，用來預(yù)測DDI，具有可較經(jīng)濟和迅速地闡明藥物對藥物代謝酶的誘導(dǎo)，從而避免采用大量動物進行藥理效應(yīng)篩選，同時易排除體內(nèi)多種因素的影響及便于作專項研究等優(yōu)點。新藥對CYP450酶的誘導(dǎo)作用已越來越受到國際醫(yī)藥界的重視，成為FDA對CYP450酶誘導(dǎo)能力評價的標準之一[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SD大鼠一只（上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2013～0016），雄性，體重200 g。

1.1.2 藥品與試劑

William’s E Medium、谷氨酰胺（292 mg/L)、雙抗溶液（含青霉素10 000 U/ml，鏈霉素10 000 mg/ml）（5 ml/500 ml）、胰島素(8 mg/ml)、5% 胎牛血清（0.22 mm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存）；PBS預(yù)灌流溶液（Dulbecco's phosphate buffered saline（10x））稀釋10倍，EDTA 0.1 mmol/L，NaHCO3調(diào)pH 7.2～7.4，0.22 mm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃保存；鼠尾膠原（0.05 mg/ml）用0.02 mol/L的醋酸稀釋，臨用現(xiàn)配；以上試劑均購自Gibco公司； Overlay（0.25 mg/mL的Matrigel（BD）（用William’s E 培養(yǎng)基稀釋，臨用現(xiàn)配）；地塞米松與利福平購自中國藥品生物制品檢定所，0.05%膠原酶Ⅳ溶液（D-Hanks溶液溶解，0.22 mm微孔濾膜過濾除菌）、Krebs-Henseleit buffer Modified、β-萘黃酮、奧美拉唑、非那西汀、睪酮均購自美國Sigma公司，試驗用水為滅菌去離子水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純及以上級別。

1.1.3 實驗儀器

48孔培養(yǎng)板、CellBIND Surface Products 48孔表面培養(yǎng)板購自Corning公司；生物安全柜（Labconco公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；TS100型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；Sigma 3K15離心機；CBS-47液氮罐；ZHWY-103B搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；Thermo Varioskan Flash 酶標儀，API4000 QTRAP型串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）以及Analyst 1.5.1數(shù)據(jù)處理軟件（美國Applied Biosystem公司）；Waters Acquity UPLC系統(tǒng)，包括四元輸液泵和自動進樣器（美國Waters公司）。

1.1.4 溶液配制

D-Hanks溶液（g/L）：CaCl20.55，NaCl 8.0，KCl 0.4，KH2PO40.06，Na2HPO4·7H2O 0.06，NaHCO30.35，超純水溶解，NaHCO3調(diào)pH 7.2～7.4，4 ℃保存。

0.02 mol/L的醋酸：115 ml的醋酸（大于99%）用水稀釋至100 ml，0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。

Krebs-Henseleit buffer（KHB）：Krebs-Henseleit buffer Modified (Sigma) 9.6 g/L，NaHCO32.2 g/L，用NaHCO3調(diào)pH至7.3。

誘導(dǎo)液（陽性化合物）用William’s E 培養(yǎng)基稀釋至地塞米松（10mol/L）、利福平（20mol/L）、β-萘黃酮（50mol/L）、奧美拉唑（100mol/L）。

探針底物非那西汀（CYP1A2）和睪酮（CYP3A4）用KHB稀釋到100mol/L和200mol/L。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代肝細胞與凍存人肝細胞誘導(dǎo)實驗?zāi)Ｐ偷慕?/p>

1.2.1.1 實驗準備

方法1 在48孔板底涂布鼠尾膠原（0.05 mg/ml）300 ml/孔，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱成膠后吸出多余膠原（時間視具體情況而定），細胞懸液種板前用William’ s E培養(yǎng)基洗去表面的酸性物質(zhì)。

方法2 CellBIND Surface Products 48孔表面培養(yǎng)板直接種細胞。

1.2.1.2 大鼠原代肝細胞誘導(dǎo)實驗

以原位二步IV型膠原灌注法消化大鼠的肝臟[9-10]，低速離心法分離肝實質(zhì)細胞

腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠（0.5 ml/100 g），仰臥固定，門靜脈插入導(dǎo)管，動脈夾固定，經(jīng)門靜脈插管以0.5 ml/min的速度勻速灌注預(yù)溫孵的PBS預(yù)灌流溶液以去除肝內(nèi)血液及鈣離子，當肝臟變蒼白、下腔靜脈流出液體變清時開始灌注預(yù)溫的膠原酶液，流速約0.1 ml/min，約6～10 min，肝臟顏色變成土黃色、包膜下呈龜背狀裂隙、壓之凹陷不易恢復(fù)時停止灌注，完整摘除肝臟。超凈臺中揭去被膜，將細胞混懸液用200目尼龍網(wǎng)篩過濾，濾液50 g低速離心3 min，沉淀用William’s E 培養(yǎng)基離心1次（50 g，3 min），接著同法洗滌2次，最后加入William’s E 培養(yǎng)基制成細胞懸液，預(yù)先在每孔中加入100 ml Williams’E 培養(yǎng)基，以防止細胞聚集，按1×106個/ml的細胞密度分別種板（CellBIND48孔表面培養(yǎng)板與包被鼠尾膠原的48孔表面培養(yǎng)板），每孔100 ml，2～6 h后（視細胞貼壁狀態(tài)而定）換William’s E培養(yǎng)基，間隔24 h換William’s E 培養(yǎng)基（含0.25 mg/ml的Matrigel）500 ml/孔，以后每天換1次William’s E 培養(yǎng)基（500 ml/孔），至第3天。第4天加入誘導(dǎo)劑（誘導(dǎo)劑用William’s E培養(yǎng)基稀釋，0.22 mm微孔濾膜過濾除菌），每天換液（誘導(dǎo)劑）至第6天。

1.2.1.3 凍存人肝細胞誘導(dǎo)實驗

細胞復(fù)蘇，低速離心（50×g，3 min），洗滌2次（William’s E 培養(yǎng)基），最后加入William’s E 培養(yǎng)基制成細胞懸液，細胞貼壁后換William’s E 培養(yǎng)基（含0.25 mg/ml的Matrigel）500 ml/孔，第2天加入誘導(dǎo)劑（每天換液（誘導(dǎo)劑）至第5天）。

1.2.1.4 誘導(dǎo)實驗及樣品處理方法

加藥前各孔加入37 ℃的空白KHB 1 ml，置于37 ℃搖床中，10 min后輕輕吸干孔內(nèi)KHB，以期在不破壞其單層膜的基礎(chǔ)上除去細胞表面的雜質(zhì)。將底物按設(shè)定濃度溶解于KHB液中，后加入各孔（48孔板加入100 ml/孔），置于37 ℃培養(yǎng)箱中，60 min時迅速吸出藥物，同時做空白對照（加入空白KHB）。取出一定量的樣品，加入等體積的含替硝唑（0.1 mg/ml）的乙腈，混合10 min沉淀蛋白，離心（6 000 g，10 min）一次，取50 ml進板。

1.2.2 樣品測定

利用探針底物的代謝物（睪酮代謝物為6-羥基睪酮，非那西汀代謝物為對乙酰氨基酚）生成量對CYP3A4和CYP1A2的酶活性進行評價。

色譜柱為Xterra C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 mm，美國Waters公司）。流動相A為0.1%甲酸-水、B為0.1%甲酸-乙腈，洗脫程序及流動相A-B配比如下：0～0.5 min 95∶5，0.5～1.0 min線性變至5∶95，1.0～2.0 min維持5∶95，2.0～2.5 min線性恢復(fù)至95∶5，2.5～3 min保持95∶5。流速0.3 ml/min，柱溫30 ℃，進樣5 ml。

離子源：電噴霧離子源（ESI），檢測方式：正離子檢測；離子源溫度（TEM）：400 ℃；霧化氣（Gas1，N2）壓力：50 psi；輔助氣（Gas 2，N2）壓力：50 psi；氣簾氣（CUR）壓力：10 psi；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；碰撞氣（CAD，N2）壓力：Medium；用于定量分析的離子反應(yīng)如表1。

表1 質(zhì)譜條件

1.2.3 數(shù)據(jù)處理[8]

相對酶活性 (% of NC)= 測試物給藥組或陽性對照組酶活性/陰性對照組酶活性× 100%。

公式中：相對酶活性反映化合物誘導(dǎo)CYP1A2和CYP3A4的能力，指加入化合物誘導(dǎo)與空白對照同時加入探針底物后代謝物生成量之比。

% 相對陽性對照活性=（給測試物組樣本活性-陰性對照組樣本活性）/（陽性對照組樣本活性-陰性對照組樣本活性）× 100%。

公式中：化合物與陽性藥作為誘導(dǎo)劑同時扣除空白對照，加入相同探針底物后代謝物生成量之比。

FDA規(guī)定陽性化合物的相對酶活性要大于2，同時規(guī)定化合物的相對酶活性大于等于陽性化合物的40%即為對CYP酶有誘導(dǎo)作用。

2 實驗結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果

大鼠肝細胞在CELLBIND48孔表面培養(yǎng)板（圖2A）與包被鼠尾膠原的48孔表面培養(yǎng)板（圖2B）種板后培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察，從細胞形態(tài)分析，兩者差異不明顯。

圖2 顯微鏡下大鼠肝細胞形態(tài)（40×）

2.2 誘導(dǎo)實驗結(jié)果

表2 原代大鼠肝細胞誘導(dǎo)實驗

表3 凍存人肝細胞誘導(dǎo)實驗結(jié)果（CELLBIND板）

3 討論

肝細胞培養(yǎng)作為一種體外模型，有其突出的優(yōu)點：與體內(nèi)情況保持一致，可以在接近生理狀態(tài)的情況下研究藥物的代謝、毒性、預(yù)測藥物-藥物相互作用的可能，排除許多復(fù)雜因素的干擾，基本保留肝臟原有的代謝功能和細胞分化狀態(tài)，具有與體內(nèi)一致的細胞色素P450酶活性。但是模型的建立過程復(fù)雜，經(jīng)過探索，誘導(dǎo)實驗主要需要注意以下幾點：①肝細胞接種后2 h開始貼壁，細胞過多會產(chǎn)生接觸抑制，貼壁率降低，而細胞培養(yǎng)板或多或少都有中間聚集效應(yīng)，同時由于肝細胞是實質(zhì)細胞，不易均勻分散種板，一般推薦采用“星型”搖板技術(shù)以均勻分散細胞，但是頻繁搖板不利于細胞貼壁[10-11]。本實驗采用預(yù)先加入100 ml William’s E 培養(yǎng)基后再加入懸浮細胞，可防止細胞聚集，效果良好；②細胞外基質(zhì)對肝細胞的生長狀態(tài)有重要的影響：膠原對細胞的貼壁生長很有幫助，但自行包被膠原，價格高、耗時長且穩(wěn)定性差。購買包被好膠原的培養(yǎng)板價格昂貴，保質(zhì)期短且需冷藏保存。CellBIND是Corning公司的專利技術(shù)，利用強微波等離子體處理培養(yǎng)表面，可以使培養(yǎng)表面結(jié)合更多的氧基，從而增強表面的親水性和穩(wěn)定性，改善細胞的貼壁，提高細胞產(chǎn)量。相對于用生化包被的方法，CellBIND表面具有更高的穩(wěn)定性，而且不需冷藏或其它特殊處理。實驗比較了細胞在CellBIND Surface Products 48孔表面培養(yǎng)板與包被鼠尾膠原的48孔表面培養(yǎng)板培養(yǎng)的結(jié)果，從細胞形態(tài)和誘導(dǎo)實驗結(jié)果分析，兩者差異不明顯，故采用CellBIND板以便簡化實驗過程。

FDA規(guī)定化合物的相對酶活性≥陽性化合物的40%即為對CYP酶有誘導(dǎo)作用，同時規(guī)定陽性化合物的相對酶活性要大于2[8]，SPH0396在0.1mol/L和1mol/L的濃度范圍內(nèi)對主要的CYP酶（1A2和3A4）無誘導(dǎo)作用，3mol/L時對CYP 3A4無誘導(dǎo)作用，對CYP1A2的相對酶活性均大于2，分別為2.7、4.35、3.17，盡管不到陽性化合物的40%，但我們認為其誘導(dǎo)CYP1A2，且原代大鼠與凍存人肝細胞無種屬差異，所以需要關(guān)注因誘導(dǎo)CYP1A2而導(dǎo)致臨床上發(fā)生藥物-藥物相互作用的可能性。

[1] Levitzki A. Tyrosine kinase inhibitor: views of selectivity sensitivity, and clinical performance[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2013, 53: 161-185.

[2] 李欣, 高金恒，陳國良. 蛋白酪氨酸激酶抑制劑的研究進展[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2011, 28(12): 1005-1021.

[3] 劉舒暢, 張健存, 陳賽娟. BCR-ABL蛋白酪氨酸激酶抑制劑的研究進展[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2010, 41(4): 293-297.

[4] 鄭敏, 白秋江, 胡躍明. 慢性髓性白血病治療藥博舒替尼[J]. 藥物流行病學(xué)雜志, 2014, 23(1): 58-60.

[5] Rabbani SA, Valentino ML, Arakelian A, et al. SKI606 (Bosutinib) blocks prostate cancer invasion, growth, and metastasis in vitro and in vivo through regulation of genes involved in cancer growth and skeletal metastasis[J]. Mol Cancer Ther, 2010, 9(5): 1147-1157.

[6] 鄭友廣, 李銘東, 吉民. 酪氨酸激酶及其小分子抑制劑研究進展[J]. 藥品評價, 2006, 3(2): 137-140.

[7] 高志偉, 施孝金, 鐘明康. 細胞色素P450酶與藥物相互作用研究進展[J]. 中國臨床藥學(xué)雜志, 2006, 15(6): 395-398.

[8] Guidance for industry: drug interaction studies — study design, data analysis, implications for dosing, and labeling recommendations[EB/OL]. [2015-04-04]. http://www.fda. gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformat ion/guidances/ucm292362.pdf.

[9] Seglen PO. Preparation of isolated rat live cells [J]. Methods Cell Biol, 1976, 13: 29-83.

[10] Kono Y, Yang S, Roberts EA. Extended primary culture of human hepatocytes in collagen gel sandwich system [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1997, 33(6): 467-472.

[11] Gómez-Lechón MJ, Lahoz A, Gombau L, et al. In vitro evaluation of potential hepatotoxicity induced by drugs[J]. Curr Pharm Des, 2010, 16(17): 1963-1977.

Study on the induction of anti-tumor candidate SPH0396 to CYP1A2 and CYP3A4

XU Jia*, XIANG Zhixiong, WAN Huixin, XIA Guangxin**
(Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd., Shanghai 201203, China)

Objective: To establish a stable and efficient experimental model using primary rat hepatocyte and cyropreserved human hepatocyte so as to study the induction of small molecule compound SPH0396 to CYP1A2 and CYP3A4. Methods: The enzyme activity was evaluated using probe substrates metabolite. Results: SPH0396 had no effect on CYP3A4 at the concentrations of 0.1 ~ 3mol/L, suggesting that SPH0396 is not an inducer of CYP3A4. However, significant induction of CYP1A2 was observed at 3mol/L of SPH0396 and the induction reached more than two times. There is no difference between rat and human hepatocytes. Conclusion: SPH0396 may cause drug-drug interaction via induction of CYP1A2 and attention should be paid in clinic to the potential of drug-drug interaction resulting from its induction to CYP1A2.

tyrosine kinase inhibitors; hepatocyte; induction

R969.2; R979.19

A

1006-1533(2015)19-0071-05

徐佳（1984-），女，工程師，主要從事藥代動力學(xué)方面的新藥研發(fā)工作。E-mail：xujia@ sphchina.com

**通訊作者：夏廣新，男，教授級高級工程師，主要從事新藥研發(fā)工作。E-mail：xiagx@sphchina.com

2015-06-03）