李 汝，逯南南，李 梅，宋武昌，孫韶華，賈瑞寶

(1.山東建筑大學市政與環(huán)境工程學院，山東 濟南 250101；2.山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，山東 濟南 250021)

費氏弧菌綜合毒性法對不同種類污染物的應急監(jiān)測試驗研究

李 汝1,2，逯南南2，李 梅1，宋武昌2，孫韶華2，賈瑞寶2

(1.山東建筑大學市政與環(huán)境工程學院，山東 濟南 250101；2.山東省城市供排水水質(zhì)監(jiān)測中心，山東 濟南 250021)

以突發(fā)水環(huán)境污染事件中常見的重金屬、農(nóng)藥和工業(yè)有機物三大類污染物為研究對象，利用海洋發(fā)光菌費氏弧菌進行發(fā)光菌綜合毒性法試驗研究。結(jié)果表明：采用凍干菌粉快速復蘇技術(shù)對重金屬、農(nóng)藥和工業(yè)有機污染物進行應急監(jiān)測時，與發(fā)光菌的接觸時間可用10 min代替?zhèn)鹘y(tǒng)的推薦接觸時間15 min；重金屬、農(nóng)藥以及工業(yè)有機污染物對費氏弧菌的發(fā)光抑制率隨特定污染物濃度增加而增大，不同特定污染物對費氏弧菌的影響程度不同，可實現(xiàn)發(fā)光菌綜合毒性法進行水質(zhì)應急監(jiān)測。

費氏弧菌；綜合毒性法；發(fā)光抑制率；水質(zhì)應急監(jiān)測技術(shù)；重金屬；農(nóng)藥；工業(yè)有機污染物

在環(huán)境污染突發(fā)事件中，污染源以及污染物一般具有不確定性[1]，水質(zhì)應急監(jiān)測以及水質(zhì)預警需要比普通理化分析方法更快速、更靈敏的監(jiān)測手段[2-4]。發(fā)光細菌(也稱發(fā)光菌)綜合毒性法[5]就是基于發(fā)光菌光效應在450～490 nm波長下發(fā)射可見熒光的生理特性進行的一種靈敏度高、相關(guān)性好、反應速度快、自動化程度高的生物毒性監(jiān)測方法[6-7]。

自1672年Boyle開始研究發(fā)光菌的發(fā)光受化學物質(zhì)抑制以來，1976年Hastings、Wilson以提出了有機物對發(fā)光菌發(fā)光抑制效應及毒性作用機制[8]，促進了生物毒性監(jiān)測的發(fā)展，隨后美國Beckman儀器公司研制了生物毒性測試系統(tǒng)(Microtox)以及便攜式毒性測定儀(Deltatox)，荷蘭microLAN B.V.公司研制了基于費氏弧菌的在線毒性測定儀(TOXcontrol)以及便攜式毒性測定儀(Check Light)等[9-10]。1995年，我國頒布了應用發(fā)光菌進行水質(zhì)毒性測試的國家標準，大量學者也利用發(fā)光菌的不同種類進行了重金屬、有機溶劑、除草劑等的毒性評價，并研究了最佳測試條件、毒性與污染物的相關(guān)性等[11-15]?；谏鲜鲅芯?，本文以突發(fā)水環(huán)境污染事件中常見的重金屬、農(nóng)藥和工業(yè)有機污染物三大類污染物為研究對象，選取海洋發(fā)光菌(費氏弧菌)對二價鋅(Zn2+)、六價鉻(Cr6+)、二價銅(Cu2+)、馬拉硫磷、百菌清、苯酚和四氯化碳等不同種類污染物進行費氏弧菌的生物綜合毒性檢測，從而得出費氏弧菌對不同種類污染物的敏感性差異、不同作用時間的發(fā)光抑制率以及適用于水質(zhì)應急檢測的作用時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

受試菌種：中科院南京土壤微生物所提供費氏弧菌(Vibriofischeri)凍干粉。

菌種復蘇稀釋液：與費氏弧菌凍干粉配套。

培養(yǎng)裝置：TOX bioshaker細菌培養(yǎng)發(fā)生器(荷蘭MicroLAN B.V.公司)。

檢測設(shè)備：Check Light-TOX-Screen3水質(zhì)毒性檢測儀(荷蘭MicroLAN B.V.公司)。

特定污染物：ZnSO4、K2Cr2O7、CuSO4、馬拉硫磷、百菌清、苯酚、四氯化碳，均為優(yōu)級純。

毒性物質(zhì)濃度設(shè)定：配置母液Zn2+為100 mg/L、Cr6+為100 mg/L、Cu2+為50 mg/L、馬拉硫磷為10 mg/L、百菌清為50 mg/L、苯酚為50 mg/L、四氯化碳為10 mg/L。各污染物的濃度系列設(shè)定見表1。

表1 污染物濃度系列設(shè)定(mg/L)

1.2 試驗方法

1.2.1 費氏弧菌的復蘇

將儲存在-20℃下的費氏弧菌凍干粉與菌種復蘇稀釋液混合，放置于TOX bioshaker細菌培養(yǎng)發(fā)生器上振蕩培養(yǎng)15 h[15-16]，目的是獲得發(fā)光度高、相對穩(wěn)定且靈敏度高的費氏弧菌懸液；然后吸取0.1 mL費氏弧菌懸液測定其原始發(fā)光量(I0)，需要發(fā)光強度大于500 000[17-18]。

1.2.2 費氏弧菌懸液樣品的預處理

采用不同污染物配制母液，試驗過程中進行不同梯度的稀釋，并調(diào)節(jié)測試樣品的滲透壓，即NaCl濃度為2%。

1.2.3 綜合毒性測試方法

試驗采用菌種復蘇稀釋液作為試驗空白與不同測試樣品用槍頭混合均勻后，在0 min、5 min、10 min、15 min時測定其發(fā)光強度，并記錄其讀數(shù)。由于測試時間內(nèi)對照樣品發(fā)光強度會發(fā)生改變，因此需按照下面公式計算測試樣品的發(fā)光抑制率[18-20]:

(1)

ICt=IS0·fk(t=5min、10min、15min)

(2)

(t=5min、10min、15min)

(3)

式中：fk為修正系數(shù)；IR5、IR10、IR15分別為5min、10min、15min后對照樣品的發(fā)光強度(cd);IR0、IS0分別為對照樣品和測試樣品的初始發(fā)光強度(cd)；ISt、ICt分別為不同時刻測試樣品的發(fā)光強度和修正發(fā)光強度(cd)。

利用試驗所得的費氏弧菌的發(fā)光抑制率與污染物濃度作發(fā)光抑制作用曲線，獲得曲線擬合方程，并可求得發(fā)光菌的半致死率EC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類污染物與費氏弧菌不同接觸時間的毒性比較

有毒污染物進入發(fā)光菌生存環(huán)境后，通過直接抑制細菌發(fā)光反應過程的酶活性，或是抑制細菌體內(nèi)發(fā)光反應相關(guān)的代謝反應進而抑制菌體發(fā)光強度。本試驗通過測定不同濃度污染物與費氏弧菌接觸時間在5min、10min、15min下的發(fā)光抑制率，來確定不同種類污染物與費氏弧菌接觸反應的合適時間。

2.1.1 重金屬類污染物

圖1至圖3為重金屬類不同濃度污染物Zn2+、Cr6+、Cu2+與費氏菌接觸時間為5min、10min、15min時的發(fā)光抑制作用曲線。由圖1至圖3可見：重金屬類污染物Zn2+、Cu2+與費氏弧菌接觸時間為10min、15min時的發(fā)光抑制作用曲線接近，且略高于接觸時間5min時的發(fā)光抑制作用曲線；重金屬類污染物Cr6+與費氏弧菌接觸時間為5min、10min、15min時的發(fā)光抑制作用曲線具有平行性，且接觸時間越長發(fā)光抑制率越大。

2.1.2 農(nóng)藥類污染物

圖4和圖5為農(nóng)藥類不同濃度污染物馬拉硫磷、百菌清與費氏弧菌接觸時間為5min、10min、15min時的發(fā)光抑制作用曲線。由圖4和圖5可見：農(nóng)藥類污染物馬拉硫磷、百菌清與費氏弧菌接觸時間為10min、15min時的發(fā)光抑制作用曲線接近，且具有平行性；農(nóng)藥類污染物低濃度下5min測定費氏弧菌發(fā)光抑制率較10min、15min的發(fā)光抑制率偏高，農(nóng)藥類污染物高濃度下5min測定費氏弧菌發(fā)光抑制率較10min、15min的發(fā)光抑制率略低。

2.1.3 工業(yè)有機污染物

圖6和圖7為工業(yè)有機污染物苯酚、四氯化碳與費氏弧菌接觸時間為5min、10min、15min時的發(fā)光抑制作用曲線。由圖6和圖7可見:工業(yè)有機污染物苯酚、四氯化碳與費氏弧菌接觸時間為5min、10min、15min時的發(fā)光抑制作用曲線在較高濃度下接近，具有一致性；在低濃度下10min、15min時的發(fā)光抑制率接近，且略高于5min。

2.2 不同種類污染物對費氏弧菌的急性毒性作用

有毒有害污染物進入水體，費氏弧菌發(fā)光強度受到抑制，其發(fā)光抑制率與污染物濃度具有一定比例關(guān)系。本試驗基于不同種類污染物與費氏弧菌不同接觸時間的毒性效應進行比較，此階段試驗采用污染物與費氏弧菌的接觸反應時間為10min進行。

2.2.1 重金屬類污染物

重金屬類污染物Zn2+、Cu2+、Cr6+對費氏弧菌的毒性效應見圖8。由圖8可見，Zn2+濃度為3mg/L

時對費氏弧菌的發(fā)光抑制率達到49.5%，Zn2+濃度為5mg/L時高達91.5%；Cu2+濃度低于1mg/L時對費氏弧菌的發(fā)光抑制率在28.2%以下，Cu2+濃度為5mg/L時高達62.18%；Cr6+濃度為70mg/L時對費氏弧菌的發(fā)光抑制率也低于50%。上述試驗結(jié)果充分說明，重金屬類污染物在較低濃度下，對費氏弧菌的毒性效應增長較快，隨著污染物濃度的增加，其對費氏弧菌的毒性效應增長趨于穩(wěn)定，且毒性效應增長速度表現(xiàn)為：Zn2+>Cu2+>Cr6+。

2.2.2 農(nóng)藥類污染物

農(nóng)藥類污染物作用于費氏弧菌，可抑制菌體發(fā)光效應。農(nóng)藥類污染物馬拉硫磷、百菌清對費氏弧菌的毒性效應見圖9。由圖9可見，馬拉硫磷、百菌清對費氏弧菌的發(fā)光抑制率隨污染物濃度的增加而逐漸增大。與其他類污染物相比，農(nóng)藥類污染物對費氏弧菌的毒性效應隨污染物濃度增加而增大的程度更快，這是因為馬拉硫磷、百菌清分別屬于有機磷類、取代苯類農(nóng)藥，費氏弧菌對有機磷類農(nóng)藥更為敏感。

2.2.3 工業(yè)有機污染物

工業(yè)有機污染物苯酚、四氯化碳對費氏弧菌的毒性效應見圖10。由圖10可見，工業(yè)有機污染物苯酚、四氯化碳在不同濃度下，可造成費氏弧菌發(fā)光抑制率的變化，污染物濃度與費氏弧菌發(fā)光強度具有一定的負相關(guān)性；苯酚對費氏弧菌的毒性效應小于四氯化碳。

2.3 不同種類污染物對費氏弧菌的毒性評價

不同種類污染物對費氏弧菌發(fā)光效應的正常代謝會造成影響，表現(xiàn)為污染物濃度越大，發(fā)光抑制程度越大，即費氏弧菌的發(fā)光抑制率與污染物濃度呈正相關(guān)。發(fā)光菌的發(fā)光強度抑制率反映污染物對發(fā)光菌的毒性大小，而發(fā)光菌的半致死率(EC50)反映發(fā)光菌對污染物的敏感程度大小，故發(fā)光菌的EC50越小，說明發(fā)光菌對污染物越敏感，污染物對發(fā)光菌的毒性越大。表2為不同污染物與費氏弧菌接觸時間為10min和15min時的發(fā)光抑制作用曲線的擬合方程和EC50。由于Cr6+濃度在70mg/L時對費氏弧菌的發(fā)光抑制率已低于50%，故K2Cr2O7對費氏弧菌的發(fā)光抑制作用曲線方程擬合不能較準確地反映六價鉻濃度對費氏弧菌發(fā)光抑制率的趨勢，且EC50>70mg/L，可見費氏弧菌對Cr6+的敏感性低于Zn2+、Cu2+。鋅元素本身是生物體發(fā)育成長所需的微量元素，其對費氏弧菌的發(fā)光抑制作用曲線的擬合方程與其他污染物不具有一致性。通過對相同接觸時間不同種類污染物的EC50進行比較，可得出費氏弧菌對不同種類污染物的敏感性順序如下：重金屬類污染物為Zn2+>Cu2+>Cr6+；農(nóng)藥類污染物為馬拉硫磷>百菌清；工業(yè)有機污染物為四氯化碳>苯酚。即不同種類污染物對費氏弧菌毒性作用排序如下：重金屬類污染物為Zn2+>Cu2+>Cr6+；農(nóng)藥類污染物為馬拉硫磷>百菌清；工業(yè)有機污染物為四氯化碳>苯酚。此外，通過對同一污染物與費氏弧菌接觸時間為10min和15min的EC50進行比較，可得出除營養(yǎng)元素鋅外，污染物與費氏弧菌接觸時間為10min時的EC50均大于或略大于15min時的EC50。

表2 不同污染物與費氏弧菌接觸時間為10 min和15 min時的發(fā)光抑制作用曲線的擬合方程和半致死率(EC50)

3 結(jié) 論

(1) 比較污染物與費氏弧菌不同接觸時間的發(fā)光抑制作用曲線，可見不同種類污染物10 min與15 min發(fā)光抑制作用曲線接近，具有一定的平行性，在應急監(jiān)測中為提高應急效率，可以選擇污染物與費氏弧菌的接觸時間為10 min。

(2) 比較三類污染物對費氏弧菌的毒性作用曲線，可見污染物對費氏弧菌的發(fā)光抑制率隨污染物濃度增加而增大，重金屬類污染物對發(fā)光菌的發(fā)光抑制作用曲線與農(nóng)藥類污染物、工業(yè)有機污染物相比其斜率較大，即說明費氏弧菌對重金屬類污染物較敏感。

(3) 根據(jù)各污染物對發(fā)光菌的發(fā)光抑制作用曲線擬合方程所得的半致死率(EC50)，可得出費氏弧菌對不同污染物的敏感程度排序和污染物對費氏弧菌的急性毒性作用排序：重金屬類污染物為Zn2+>Cu2+>Cr6+；農(nóng)藥類污染物為馬拉硫磷>百菌清；工業(yè)有機污染物為四氯化碳>苯酚。除營養(yǎng)元素鋅外，污染物與費氏弧菌接觸時間為10 min時的EC50大于或略大于15 min時的EC50。

(4) 費氏弧菌應急監(jiān)測是一種快速篩選生物毒性的綜合毒性法，其反應速度快、準確度較高，適合作為水質(zhì)常規(guī)監(jiān)測技術(shù)的補充手段，并在快速檢測中有著廣泛應用前景，對保障水質(zhì)安全具有指導意義。

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Experiment Study of the Emergency Monitoring on Different Types of Pollutants byVibrioFischeriComprehensive Toxicity Method

LI Ru1,2,LU Nannan2,LI Mei1,SONG Wuchang2,SUN Shaohua2,JIA Ruibao2

(1.CollegeofEnvironmentalandMunicipalEngineering,ShandongJianzhuUniversity,Jinan250101,China；2.ShandongProvinceCityWaterSupplyandDrainageWater
QualityMonitoringCenter,Jinan250021,China)

This paper takes three common types of pollutants,namely heavy metals in water,pesticides and organic matter,as the research object,and applies the marine luminousVibrioFischerito the experiment study of the comprehensive toxicity of luminous bacteria.The result shows that by using freeze-dried powder rapid recovery technology for emergency monitoring,the contact time between bacteria and heavy metals,pesticides,poisonous and industrial organic pollutants is 10 min instead of the standard 15 min.Specific pollutants including heavy metals,agriculture chemicals and poisonous and harmful organics influence the bacteria light,and the light-limit rate increases with the concentration of pollutants.The influence of different pollutants is at different levels,which can realize the emergency monitoring of water quality by luminous bacteria comprehensive toxicity method.Key words:Vibriofischeri;comprehensive toxicity;light-limit rate;emergency monitoring technology for water quality;heavy metal;pesticide chemical;poisonous organic pollutant

1671-1556(2015)04-0104-06

2014-12-03

2015-05-08

山東省自然科學基金項目(ZR2014CP019)；國家水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07404-003)；國家科技部項目(直飲水科技惠民示范工程)(2013GS370202)

李 汝(1989—)，女，碩士研究生，主要研究方向為飲用水安全。E-mail：liru01@yeah.net

X832

A

10.13578/j.cnki.issn.1671-1556.2015.04.018

賈瑞寶(1968—)，男，研究員，主要從事城市供水污染控制、供水應急處理等方面的研究。E-mail：jiaruibao68@126.com