付海明 岳建偉

基礎研究

TGF-β1和b-FGF在腎血管性高血壓大鼠血管重塑中的作用

付海明 岳建偉

作者單位：014030 內蒙古自治區(qū)包頭市，包頭市婦幼保健所（付海明）；包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院心內科（岳建偉）

目的 探討堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF）和轉化生長因子β1（TGF-β1）在腎血管性高血壓大鼠血管重塑中的作用機制。方法 將8周齡健康雄性wistar大鼠40只隨機分為對照組和模型組，每組各20只，按照“二腎一夾”法制備高血壓大鼠模型。每周檢測大鼠尾動脈收縮壓1次。8周后處死取頸總動脈、腹主動脈做形態(tài)學觀察，免疫組織化學法檢測動脈管壁中b-FGF和TGF-β1的蛋白表達。結果 與對照組相比，模型組尾動脈收縮壓增高［（149.76±7.56）mm Hg比（88.68±3.96）mm Hg，P＜0.01］；動脈中膜增厚（P＜0.05）；管壁 b-FGF、TGF-β1表達增強（P＜0.01）；b-FGF 與 TGF-β1 表達呈正相關，在頸總動脈 r=0.88，在腹主動脈r=0.87，均P＜0.01。結論 b-FGF、TGF-β1可能促進了高血壓血管重塑的病理過程，二者間可能存在相互作用。

腎血管性高血壓；大鼠；血管重塑；堿性成纖維細胞生長因子；轉化生長因子β1

血管重塑（vascular remodeling，VR）存在于高血壓發(fā)生、發(fā)展的全過程，是高血壓維持、發(fā)展及靶器官損害以至功能衰竭的病理結構基礎，改善血管重塑能有效降低高血壓患者的終點事件，因此對高血壓狀態(tài)下血管重塑的機制進行研究具有重要意義。國內外已有研究發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子β1（TGF-β1）可促進腎性高血壓大鼠的血管重塑[1]，堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF）可促進腎性高血壓大鼠的心肌重塑[2]，但在“二腎一夾”型高血壓大鼠血管重塑中是否存在相互作用報道甚少。本研究通過觀察b-FGF、TGF-β1在“二腎一夾”型高血壓大鼠頸總動脈、腹主動脈管壁中蛋白表達的變化，探討其在血管重塑中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 選取體重180～220 g的健康8周齡雄性wistar大鼠40只。大鼠購于內蒙古大學動物實驗中心。兔抗人b-FGF免疫組化多克隆抗體、兔抗人TGF-β1免疫組化多克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色劑均購于福州邁新有限責任公司。

1.2 模型制備與分組 將40只wistar大鼠按配偶設計隨機分組為實驗組（20只）和對照組（20只）。測量正常大鼠血壓后，根據(jù)文獻[3]進行“兩腎一夾”型高血壓大鼠模型的制備。實驗組：用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40 mg/kg），沿腹正中線開腹，無菌操作，暴露左腎并鈍性分離左腎動脈，于左腎動脈分岔前套上銀夾（直徑為0.2 mm），使左腎動脈落入銀夾的小孔內，夾閉銀夾兩端，造成狹窄，輕輕提起銀夾，腎臟變白，松開后回復正常顏色，并確定腎臟無明顯淤血和蒼白，對側腎及腎動脈不觸及，術后4～8 周血壓穩(wěn)定，鼠尾收縮壓＞140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）為造模成功。最終有15只大鼠手術成功。對照組：開腹后分離左腎動脈但不鉗夾，其他操作同實驗組。最終15只大鼠存活。術后給予青霉素腹腔注射預防感染，分籠飼養(yǎng)，自由進食水，每周測量尾動脈收縮壓1次。

1.3 測量血壓 分別于術前及術后第7天開始應用BL-420系列生物機能實驗系統(tǒng)血壓心率測定儀測定大鼠鼠尾收縮壓（尾套法），每次測量重復3次后取平均值，每周測量1次。8周后處死大鼠。

1.4 血管重塑指標測定及管壁b-FGF、TGF-β1蛋白表達檢測 將大鼠處死后取頸總動脈和腹主動脈，行石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅染色，應用Image ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量中膜厚度/血管內徑（MT/LD）。采用S-P免疫組化法檢測動脈管壁 b-FGF、TGF-β1活性，PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對照，b-FGF用食管癌組織、TGF-β1用乳腺癌組織作陽性對照。制作石蠟切片，脫蠟、水化，3%H2O2水溶液處理，高壓熱抗原修復，過氧化酶阻斷內源性過氧化物酶活性，再滴加b-FGF或TGF-β1抗體，4℃過夜，生物素標記，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水、干燥、透明，中性樹膠固定。顯微鏡400倍、統(tǒng)一光圈下觀察，應用Image ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)行半定量分析，測量b-FGF、TGF-β1蛋白表達的積分光密度值。

1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計學處理。所得數(shù)據(jù)用±s表示，使用t檢驗進行兩組間比較，相關性采用pearson等級相關性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組尾動脈收縮壓比較 術前兩組大鼠尾動脈收縮壓無明顯差異。術后8周模型組尾動脈收縮壓為（149.76±7.56）mm Hg，與對照組血壓（88.68±3.96）mm Hg相比明顯升高，t檢驗兩組大鼠血壓差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 兩組大鼠頸總動脈、腹主動脈血管重塑及b-FGF、TGF-β1蛋白的表達變化 兩組大鼠頸總動脈及腹主動脈 MT/LD、b-FGF、TGF-β1蛋白表達情況見表1、圖1-3。

2.3 b-FGF與TGF-β1的相關性分析 將頸總動脈 b-FGF 與 TGF-β1 行相關性分析：r=0.88，P＜0.01；將腹主動脈b-FGF與TGF-β1行相關性分析，r=0.87，P＜0.01，均呈顯著正相關。

表1 兩組大鼠頸總動脈重塑指標、b-FGF、TGF-β1表達的變化（±s）

表1 兩組大鼠頸總動脈重塑指標、b-FGF、TGF-β1表達的變化（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01

腹主動脈MT/LD（×10-2） b-FGF（IOD）（D/μm2） TGF-β1（IOD）（D/μm2） MT/LD（×10-2） b-FGF（IOD）（D/μm2） TGF-β1（IOD）（D/μm2）對照組 15 13.88±0.84 12.20±0.34 6.15±0.28 7.44±0.87 9.69±0.97 5.25±1.08模型組 15 19.29±1.17a 15.73±0.48a 8.06±0.78a 9.26±0.56a 12.81±0.40a 8.32±0.70a組別 例數(shù) 頸總動脈

3 討論

血管重塑是高血壓維持、發(fā)展的病理結構基礎，是一個動態(tài)過程，是血管在機體生長、發(fā)育、衰老和病理過程中，為適應體內外環(huán)境變化而發(fā)生的形態(tài)、結構及功能的動態(tài)反應過程，其包括信號感受、轉導，調節(jié)因子的合成、釋放，最終產(chǎn)生結構變化[4]。血管重塑的主要特征是中層平滑肌細胞的增生、肥大、遷移[5]。此外，還存在細胞外基質包括膠原纖維、彈力纖維等的增多，造成血管壁增厚、管腔狹窄、壁腔比增高、管壁順應性下降的病理變化[6-8]?！岸I一夾”法制作高血壓大鼠模型的技術已經(jīng)成熟并逐步改進[9]，其機制與循環(huán)及局部 RAS激活密切相關[10]。本研究結果顯示，模型組大鼠的血壓增高，且頸總動脈、腹主動脈的MT/LD均明顯大于對照組，證實了模型制作成功，且血管中膜增厚是血管重塑的主要變化。

b-FGF是一種多效能的細胞生長因子，可促進細胞分裂增殖，增強有絲分裂活性。b-FGF還是一種強的血管源性生長因子，可刺激血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、成纖維細胞的生長。在容量、壓力超負荷等多種病理狀態(tài)導致的心肌肥大過程中，b-FGF表達均顯著增強[11,12]，說明其參與了心肌肥大的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，在模型組重塑的血管壁中b-FGF呈強陽性表達，明顯高于對照組，說明b-FGF有促進高血壓血管重塑的作用。

TGF-β1是TGF-β家族中的一員。TGF-β1對心血管系統(tǒng)而言是最重要的異構體，多在內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和造血細胞等多種細胞中表達[13]。已有研究證實，TGF-β1在腎血管性高血壓大鼠的血管重塑中起促進作用[1,14,15]；在高血壓伴心腎靶器官損害患者的血清中明顯增高，可能獨立于血壓水平參與了靶器官損害的病理生理過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在模型組重塑的血管壁中TGF-β1蛋白表達明顯高于對照組。這與上述研究結果相一致。

本研究結果還顯示，b-FGF與TGF-β1之間存在正相關關系，考慮二者在血管重塑中存在協(xié)同作用。有研究[17]顯示，TGF-β可刺激其他生長因子如血小板源性生長因子和b-FGF產(chǎn)生，從而促進VSMC重塑的發(fā)展，但具體機制有待進一步研究。

圖1 頸總動脈、腹主動脈的組織形態(tài)學觀察（HE染色×400）

圖2 頸總動脈、腹主動脈的b-FGF活性表達（×400），呈棕黃色顆粒

圖3 頸總動脈、腹主動脈的TGF-β1活性表達（×400），呈棕黃色顆粒

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The role of b-FGF and TGF-β1 in vascular remodeling of renovascular hypertension rats

FU Hai-ming＊，YUE Jian-wei.＊The Maternal and Child Health Hospital of Baotou City，Baotou 014030，China

YUE Jian-wei，E-mail：Yueyuejianwei@126.com

ObjectiveTo investigate the mechanism of b-FGF and TGF-β1 in vascular remodeling of renovascular hypertensive rats.Methods8 weeks Wistar male rats were randomly divided into control group，model group.The renovacular hypertensive rats was induced by two-kidney-one-clip method.Systolic blood pressure（SBP）of rats was detected once a week.Rat were sacrificed after 8 weeks，Carotid artery and abdominal aorta were taken.The morphologic change was observed by light microscope.Then the expression of b-FGF and TGF-β1 were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the control group，the SBP was significantly increased in the model group［（149.76±7.56）mm Hg vs （88.68±3.96）mm Hg，P＜0.01］，also the MT/LD was significantly increased in the model group（P＜0.05），b-FGF and TGF-β1 of arterial wall in model group was significantly increased（P＜0.01）.b-FGF expression was positively correlated with TGF-β1，In the carotid artery，r=0.88（P＜0.01），and in the abdominal aorta，r=0.87（P＜0.01）.ConclusionB-FGF，TGF-β1 involved in the pathological process of hypertensive vascular remodeling.There is probably a interactive regulation between them.

Renovascular hypertensive；Rats；Vascular remodeling；b-FGF；TGF-β1

岳建偉，E-mail：Yueyuejianwei@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.01.025

Q95-33；R654.2

A

1672-5301（2015）01-0089－03

2014-09-28）